347 12.7 * 1.24 mm

Nature.com نى زىيارەت قىلغىنىڭىزغا رەھمەت.سىز چەكلىك CSS قوللىشى بىلەن توركۆرگۈ نۇسخىسىنى ئىشلىتىۋاتىسىز.ئەڭ ياخشى تەجرىبە ئۈچۈن يېڭىلانغان تور كۆرگۈچنى ئىشلىتىشىڭىزنى تەۋسىيە قىلىمىز (ياكى Internet Explorer دىكى ماسلىشىشچان ھالەتنى چەكلەڭ).ئۇنىڭدىن باشقا ، داۋاملىق قوللاشقا كاپالەتلىك قىلىش ئۈچۈن ، ئۇسلۇب ۋە JavaScript بولمىغان تور بېكەتنى كۆرسىتىمىز.
تام تەسۋىردە ھەر بىر تام تەسۋىردە ئۈچ ماقالە كۆرسىتىلىدۇ.كەينى ۋە كېيىنكى كۇنۇپكىلارنى ئىشلىتىپ تام تەسۋىردىن يۆتكىڭ ياكى ئاخىرىدا تام تەسۋىر كونترول كۇنۇپكىسى ئارقىلىق ھەر بىر تام تەسۋىردىن ئۆتۈڭ.

347 داتلاشماس پولات تۇرۇبا ئۆلچىمى

347 12.7 * 1.24mm داتلاشماس پولاتتىن ياسالغان تۇرۇبا

سىرتقى دىئامېتىرى: 6.00 مىللىمېتىر OD 914.4 مىللىمېتىرغا يېتىدۇ ، چوڭلۇقى 24 گە يېتىدۇ »NB بار Ex-stock ، OD رازمېرلىق پولات تۇرۇبا بار Ex-stock

SS 347 تۇرۇبا قېلىنلىقى: 0.3mm - 50 مىللىمېتىر ، SCH 5 ، SCH10 ، SCH 40 ، SCH 80 ، SCH 80S ، SCH 160 ، SCH XXS ، SCH XS
WT: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S قاتارلىقلار (0.5-12mm) ياكى تەلەپكە ئاساسەن ماس كېلىدىغان دائىملىق ئەمەس

تىپى: SS 347 يوچۇقسىز تۇرۇبا |SS 347 ERW تۇرۇبا |SS 347 كەپشەرلەنگەن تۇرۇبا |SS 347 ياسالغان تۇرۇبا |SS 347 CDW تۇرۇبىسى ، LSAW تۇرۇبىسى / كەپشەرلەنگەن / قايتا سىزىلغان

شەكلى: SS 347 يۇمىلاق تۇرۇبا / تۇرۇبا ، SS 347 كۋادرات تۇرۇبا / تۇرۇبا ، SS 347 تىك تۆت بۇلۇڭلۇق تۇرۇبا / تۇرۇبا ، SS 347 كاتەكچە تۇرۇبا ، SS 347 «U» شەكلى ، SS 347 قازان تورت ، SS 347 سۇيۇقلۇق تۇرۇبىسى.

ئۇزۇنلۇقى: يەككە تاسادىپىي ، قوش تاسادىپىي ۋە تەلەپ قىلىنغان ئۇزۇنلۇق ئاخىرى: تۈزلەڭلىك ئۇچى ، كەسمە ئۇچى ، چېكىلگەن

ئاخىرقى قوغداش: سۇلياۋ دوپپا |سىرتى تاماشا: 2B ، 44 ، 11 ، 8-نومۇرلۇق ئەينەك داتلاشماس پولات تۇرۇبا ئۈچۈن ئەينەك تاماملاش ، خېرىدارلارنىڭ تەلىپىگە ئاساسەن تاماملاش

يەتكۈزۈش ئەھۋالى: چاپلانغان ۋە چىلانغان ، سىلىقلانغان ، پارقىراق ، سوغۇق سىزىلغان

تەكشۈرۈش ، سىناق دوكلاتى: زاۋۇت سىناق گۇۋاھنامىسى ، EN 10204 3.1 ، خىمىيىلىك دوكلات ، مېخانىكىلىق دوكلات ، PMI سىناق دوكلاتى ، كۆرۈنۈش تەكشۈرۈش دوكلاتى ، ئۈچىنچى تەرەپ تەكشۈرۈش دوكلاتى ، NABL تەستىقلانغان تەجرىبىخانا دوكلاتى ، بۇزغۇنچىلىق خاراكتېرلىك سىناق دوكلاتى ، بۇزغۇنچىلىق خاراكتېرلىك سىناق دوكلاتى.

ئوراش: ياغاچ ساندۇقلارغا ، سۇلياۋ خالتىغا ، پولات چىۋىقلارغا باغلانغان ياكى خېرىدارلارنىڭ تەلىپىگە ئاساسەن قاچىلانغان

ئالاھىدىلىكى: يۇقىرىدىن باشقا چوڭ-كىچىكلىكى ۋە ئۆلچىمى تەلەپ بويىچە ئىشلەپچىقىرىلىدۇ

SS 347 تۇرۇبا چوڭلۇقى: 1/2 ديۇملۇق NB ، OD دىن 24 دىيۇمغىچە

ASTM A312 347: يۇقىرى تېمپېراتۇرا ۋە ئادەتتىكى چىرىتىش مۇلازىمىتى ئۈچۈن لايىھەلەنگەن يوچۇقسىز ۋە تۈز شەكىللىك كەپشەرلەنگەن ئاۋستېنتىك تۇرۇبا.كەپشەرلەش جەريانىدا تولدۇرغۇچى مېتال رۇخسەت قىلىنمايدۇ.

ASTM A358 347: ئېلېكتر بىرىكمىسى چىرىتىش ۋە / ياكى يۇقىرى تېمپېراتۇرا مۇلازىمىتى ئۈچۈن كەپشەرلەنگەن.ئادەتتە بۇ ئۆلچەمگە پەقەت 8 دىيۇمغىچە تۇرۇبا ئىشلەپچىقىرىلىدۇ.كەپشەرلەش جەريانىدا تولدۇرغۇچى مېتال قوشۇشقا رۇخسەت قىلىنىدۇ.

ASTM A790 347.

ASTM A409 347.

ASTM A376 347: يۇقىرى تېمپېراتۇرا قوللىنىش ئۈچۈن يوچۇقسىز ئاۋستېنتىك تۇرۇبا.

ASTM A813 347: يۇقىرى تېمپېراتۇرا ۋە ئادەتتىكى چىرىتىشكە ئىشلىتىلىدىغان تاق تاق ، تاق ياكى قوش كەپشەرلەنگەن ئاۋستېنتىك تۇرۇبا.

ASTM A814 347: يۇقىرى تېمپېراتۇرا ۋە ئادەتتىكى چىرىتىش مۇلازىمىتى ئۈچۈن سوغۇق ئىشلەنگەن كەپشەرلەنگەن ئاۋستېنتىك تۇرۇبا.

347H داتلاشماس پولات تۇرۇبا خىمىيىلىك تەركىبى

داتلاشماس پولات 347H تۇرۇبا مېخانىكىلىق خۇسۇسىيىتى

داتلاشماس پولات 347H تۇرۇبا فىزىكىلىق خۇسۇسىيىتى

347H داتلاشماس پولات تۇرۇبىنىڭ ئوخشاش دەرىجىسى

ئامىلوئىد ئالفا-سىنۇكلېئىن (αS) توپلىنىشى پاركىنسون كېسىلى ۋە باشقا بىرىكمە كېسەللىكلەرنىڭ ئالاھىدىلىكى.يېقىندا ، ئادەتتە ئالزىمېر كېسەللىكى بىلەن مۇناسىۋەتلىك بولغان تاۋ ئاقسىلى αS كېسەللىكلىرى بىلەن مۇناسىۋەتلىك بولۇپ ، αS مول بولغان بىرىكمىلەردە ئۆز-ئارا يەرلىكلەشتۈرۈلگەنلىكى بايقالغان ، گەرچە بۇ ئىككى خىل ئاقسىلنىڭ توپلىنىشىنىڭ مولېكۇلا مېخانىزىمى ئېنىق ئەمەس.بىز بۇ يەردە دوكلات قىلىمىزكى ، αS باسقۇچى تاۋ قاتارلىق مۇسبەت زەرەتلەنگەن پولى پېپتىدلار بىلەن ئېلېكتروستاتتىك مۇرەككەپ قويۇقلىشىش ئارقىلىق سۇيۇق قويۇق ھالەتكە ئايرىلىدۇ.كۆپ قۇتۇپلىشىشنىڭ αS نىڭ يېقىنلىقى ۋە قېتىشىش تورىنىڭ ۋالېنس خورىتىش سۈرئىتىگە ئاساسەن ، دانىخورەك تېز سۈرئەتتە يىغىلىش ياكى بىرىكىشتىن كېيىن ئاستا ئامىلوئىد يىغىلىدۇ.بىر يۈرۈش ئىلغار بىئوفىزىكىلىق تېخنىكىلارنى بىرلەشتۈرۈش ئارقىلىق ، بىز سۇيۇقلۇق-سۇيۇقلۇق αS / Tau باسقۇچىنىڭ ئايرىلىشىنى خاراكتېرلەندۈرۈپ ، سۇيۇق ئاقسىل قويۇقلۇقىدىكى ھەر ئىككى ئاقسىلنى ئۆز ئىچىگە ئالغان ئوخشىمىغان گۇرۇپپىلارنىڭ شەكىللىنىشىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدىغان ھالقىلىق ئامىللارنى ئېنىقلىيالىدۇق.
پەردى بۆلەكلىرىدىن باشقا ، سۇيۇقلۇق-سۇيۇقلۇق فازا ئايرىش (LLPS) دەپ ئاتىلىدىغان جەريان ئارقىلىق ، ئاقسىل مول ، بىئولوگىيىلىك مول قويۇقلۇق ياكى تامچە دەپ ئاتىلىدىغان سۇيۇقلۇققا ئوخشاش قويۇق بەدەننىڭ شەكىللىنىشى ئارقىلىق ھۈجەيرىلەردە بوشلۇقنى ئايرىشقا بولىدۇ.بۇ تامچىلار كۆپ خىل ۋاقىتلىق ئۆز-ئارا تەسىر ئارقىلىق شەكىللەنگەن بولۇپ ، ئادەتتە ئاقسىل ياكى ئاقسىل بىلەن RNA ئارىسىدا بولۇپ ، بارلىق ھاياتلىق سىستېمىلىرىدا دېگۈدەك ھەر خىل ئىقتىدارلارغا خىزمەت قىلىدۇ.زور مىقداردىكى LLP ئىقتىدارىغا ئىگە ئاقسىل تۆۋەن دەرىجىدىكى مۇرەككەپلىكنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ ، بۇ تەبىئەتتە ئىنتايىن قالايمىقان ۋە بىئولوگىيىلىك مول قويۇقلۇقنىڭ شەكىللىنىشىدە 3،4،5.نۇرغۇنلىغان تەجرىبە تەتقىقاتى بۇ سۇيۇقلۇققا ئوخشاش قويۇق ماددىلارنى تەشكىل قىلىدىغان ئاقسىلنىڭ ئەۋرىشىم ، دائىم تەرتىپسىز ۋە كۆپ خىللىقىنى ئاشكارىلىدى ، گەرچە بۇ قويۇق ماددىلارنىڭ ئۆسۈشىنى ۋە يېتىلىشىنى كونترول قىلىدىغان كونكرېت مولېكۇلا ئېنىقلىغۇچىلار ھەققىدە ئاز بولسىمۇ. ئىشتات..
يېڭى سانلىق مەلۇماتلار ئاقسىل ئارقىلىق قوزغىتىلغان LLPS ۋە تامچىلىرىنىڭ قاتتىق قۇرۇلمىغا ئايلىنىشى مۇناسىۋەتلىك ھۈجەيرىلىك يول بولۇشى مۇمكىن ، ئۇلار دائىم چېكىنىش خاراكتېرلىك كېسەللىكلەرنىڭ ئالاھىدىلىكى بولغان ئېرىيدىغان زەھەرلىك بىرىكمىلەرنىڭ شەكىللىنىشىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ.نۇرغۇن LLPS بىلەن مۇناسىۋەتلىك ئىچكى قالايمىقانلاشقان ئاقسىل (IDP) ھەمىشە يۇقىرى توك قاچىلانغان ۋە ئەۋرىشىم بولۇپ ، ئۇزۇندىن بۇيان ئامىلوئىد يىغىلىش جەريانىدا نېرۋا ئاجىزلاش بىلەن مۇناسىۋەتلىك.بولۇپمۇ ، FUS7 ياكى TDP-438 غا ئوخشاش بىئولوگىيىلىك مولېكۇلا قويۇقلۇقى ياكى hnRNPA19 غا ئوخشاش تۆۋەن دەرىجىدىكى مۇرەككەپ دائىرىدىكى ئاقسىللار سۇيۇقلۇقلىشىش دەپ ئاتىلىدىغان جەريان ئارقىلىق گېلىغا ئوخشاش ھەتتا قاتتىق شەكىلگە ئايلانغان.بىرىكمە.پۇختا باسقۇچقا ئۆتۈش (LSPT) ۋاقىتنىڭ فۇنكسىيەسى سۈپىتىدە ياكى تەرجىمىدىن كېيىنكى بەزى ئۆزگەرتىشلەرگە ياكى پاتولوگىيىلىك ئەھمىيەتكە ئىگە ئۆزگىرىشلەرگە جاۋابەن.
Vivo دىكى LLPS بىلەن مۇناسىۋەتلىك يەنە بىر IDP بولسا Tau بولۇپ ، مىكروبولۇب بىلەن مۇناسىۋەتلىك قالايمىقان ئاقسىل ، ئۇنىڭ ئامىلوئىد توپلىنىشى ئالزىمېر كېسەللىكى بىلەن مۇناسىۋەتلىك 10 ، ئەمما ئۇ يېقىندا پاركىنسون كېسىلى (PD) ۋە باشقا ماس قەدەملىك يادرو ئاقسىلى بىلەن مۇناسىۋەتلىك.تاۋنىڭ ئېلېكتر سىتاتىك ئۆز-ئارا تەسىر قىلىشى سەۋەبىدىن ئېرىتمىسى / سىتوپلازمىدىن ئۆزلۈكىدىن ئايرىلىدىغانلىقى كۆرسىتىلدى ، نەتىجىدە ئېلېكتر سىتاتىك كوكراتسى دەپ ئاتىلىدىغان تاۋ موللاشتۇرۇلغان تامچە شەكىللەندى.بۇ خىل ئالاھىدە بولمىغان ئۆز-ئارا تەسىرنىڭ تەبىئەتتىكى نۇرغۇن بىئولوگىيىلىك مول قويۇقلۇقنىڭ ھەرىكەتلەندۈرگۈچ كۈچى ئىكەنلىكىمۇ كۆزىتىلدى.تاۋ ئاقسىلىغا كەلسەك ، ئېلېكتىروستاتتىك يىغىلىش ئاددىي يىغىلىش ئارقىلىق شەكىللىنىدۇ ، بۇنىڭدا ئاقسىلنىڭ قارشى زەرەتلەنگەن رايونلىرى ئايرىش جەريانىنى قوزغايدۇ ياكى RNA قاتارلىق سەلبىي زەرەتلەنگەن پولىمېرلار بىلەن ئۆز-ئارا تەسىر كۆرسىتىش ئارقىلىق مۇرەككەپ يىغىلىش ئارقىلىق ھاسىل بولىدۇ.
يېقىندا ، PD ۋە باشقا نېرۋا ئاجىزلىق كېسەللىكلىرىگە چېتىشلىق ئامىلوئىد IDP α-synuclein (αS) ھۈجەيرە ۋە ھايۋانات مودېللىرىدا سۇيۇقلۇققا ئوخشاش ھەرىكەتلەر بىلەن ئاقسىل قويۇقلۇقىدا 19،20 قويۇلدى.ۋىرۇس تەتقىقاتىدا كۆرسىتىلىشىچە ، αS ئاساسلىقى گىدروپوبىكلىق ئۆز-ئارا تەسىر ئارقىلىق ئاددىي يىغىلىش ئارقىلىق LLPS نى باشتىن كەچۈرگەن ، گەرچە بۇ جەرياندا ئاقسىلنىڭ قويۇقلۇقى ۋە ئادەتتە ئۇزۇن يوشۇرۇن دەۋرى 19،21 بولغان.Vivo دا كۆزىتىلگەن αS بار قويۇق ماددىلارنىڭ بۇ ياكى باشقا LLPS جەريانلىرى تەرىپىدىن شەكىللەنگەن ياكى شەكىللەنمىگەنلىكى يەنىلا ھەل قىلىنمىغان مەسىلە.ئوخشاشلا ، گەرچە PD ۋە باشقا سىنوكلېئىنوپاتىدىكى نېرۋا ھۈجەيرىسىدە αS ئامىلوئىدنىڭ يىغىلىشى بايقالغان بولسىمۇ ، ئەمما αS نىڭ ھۈجەيرە ئىچىدىكى ئامىلوئىد توپلىنىشىنى باشتىن كەچۈرگەن ئېنىق مېخانىزم ئېنىق ئەمەس ، چۈنكى بۇ ئاقسىلنىڭ ھەددىدىن زىيادە بېسىم قىلىشى بۇ جەرياننى ئۆزى قوزغىتالمايدۇ.قوشۇمچە ھۈجەيرە بۇزۇلۇشى دائىم تەلەپ قىلىنىدۇ ، بۇ ھۈجەيرە ئىچىدىكى αS ئامىلوئىد قۇراشتۇرۇشىنىڭ ئۆزگەرتىلىشى ئۈچۈن مەلۇم ھۈجەيرە ئورنى ياكى مىكرو مۇھىتنىڭ تەلەپ قىلىنىدىغانلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ.يىغىلىشقا ئاسان ئۇچرايدىغان بىر ھۈجەيرە مۇھىتى ئاقسىل قويۇقلۇقىنىڭ ئىچكى قىسمى بولۇشى مۇمكىن.
قىزىقارلىق يېرى ، αS بىلەن تاۋنىڭ پاركىنسون كېسىلى ۋە باشقا بىرىكمە كېسەللىكلەر بار ئىنسانلاردىكى ئالاھىدىلىك خاراكتېرلىك كېسەللىكلەرنىڭ ئۆز-ئارا ماسلىشىشىدا 24،25 بايقالغانلىقى ۋە تەجرىبىلەرنىڭ كۆرسىتىشىچە ، بۇ ئىككى خىل ئاقسىل ئوتتۇرىسىدىكى بىرىكمە كېسەللىك مۇناسىۋىتى 26،27 بولۇپ ، αS بىلەن يىغىلىشنىڭ يوشۇرۇن مۇناسىۋىتى بارلىقىنى كۆرسىتىپ بەرگەن. نېرۋا ئاجىزلىق كېسەللىكلىرى.كېسەل.αS بىلەن تاۋنىڭ ئۆز-ئارا تەسىر كۆرسىتىدىغانلىقى ۋە بىر-بىرىنىڭ يىغىلىشىنى ئىلگىرى سۈرىدىغانلىقى بايقالدى ۋە vivo دا 28،29 ۋە بۇ ئىككى خىل ئاقسىلدىن تەركىب تاپقان گېروگېنلىق بىرىكمە بىرىكمە 30 بىمارنىڭ مېڭىسىدە بايقالغان.قانداقلا بولمىسۇن ، αS بىلەن تاۋنىڭ ئۆز-ئارا تەسىرلىشىشىنىڭ مولېكۇلا ئاساسى ۋە ئۇنى بىرلەشتۈرۈش مېخانىزمى ھەققىدە ئاز بىر قىسىم ئۇچۇرلار بار.αS نىڭ سەلبىي زەرەتلەنگەن C تېرمىنال رايونى بىلەن مەركىزىي پرولىن مول بولغان تاۋ رايونى ئوتتۇرىسىدىكى ئېلېكتر سىتاتىك تارتىش ئارقىلىق تاۋ بىلەن ئۆز-ئارا تەسىر كۆرسىتىدىغانلىقى خەۋەر قىلىنغان بولۇپ ، بۇ رايوندا ئاكتىپ زەرەتلەنگەن قالدۇقلارمۇ موللاشتۇرۇلغان.
بۇ تەتقىقاتتا ، αS نىڭ پولى- L- لىزىن (pLK) قاتارلىق ئاكتىپ مۇسبەت زەرەتلەنگەن كۆپ خىل پېپتىدلار بىلەن بولغان ئۆز-ئارا تەسىرگە سېلىشتۇرغاندا ، تاۋ ئاقسىلى بارلىقىدا ئېلېكتر سىتاتىك مۇرەككەپ قويۇقلىشىش ئارقىلىق تامچەغا ئايرىلىدىغانلىقىنى كۆرسىتىمىز.αS تامچە تورى ئۈچۈن تاياقچە مولېكۇلا رولىنى ئوينايدۇ.بىز ئېلېكتىروستاتىك αS كوئوردېناتنىڭ يېتىلىش جەريانىدىكى كۆرۈنەرلىك پەرقلەرنى بايقىدۇق ، بۇلار كوكۇس تورىغا قاتناشقان ئاقسىلنىڭ ئۆز-ئارا تەسىر كۈچىنىڭ كۈچلۈكلۈكى ۋە كۈچلۈكلىكى بىلەن مۇناسىۋەتلىك.قىزىقارلىق يېرى ، بىز ئۇزۇن ئۆمۈر كۆرىدىغان سۇيۇقلۇق كوئوردېناتتا αS ۋە تاۋ ئامىلوئىد ئاقسىلىنىڭ ئورتاق يىغىلىشىنى كۆزىتىپ ، بۇ خىل ئاقسىلنىڭ بۇ ئىككى خىل ئاقسىلنىڭ بىرىكىشىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدىغان بىر قىسىم مۇھىم ئامىللارنى بايقىدۇق.بۇ يەردە بىز بۇ جەرياننى تەپسىلىي تەسۋىرلەپ ئۆتىمىز ، بۇ بەلكىم كېسەللىككە چېتىشلىق ئىككى خىل ئاقسىلنىڭ بىرىكىشىدىكى يوشۇرۇن مولېكۇلا مېخانىزىمى.
αS نىڭ نېيترال pH دا يۇقىرى ئانئونىك C تېرمىنال قۇيرۇقى بار (1a رەسىم) ، بىز ئۇنىڭ كۆپ قۇتۇپلۇق قالايمىقانلاشقان كۆپ قۇتۇپلۇق مولېكۇلا بىلەن ئېلېكترو سىتاتىك مۇرەككەپ ماددىلارنىڭ قويۇقلۇقى ئارقىلىق LLPS نى باشتىن كەچۈرەلەيدىغانلىقىنى پەرەز قىلدۇق.بىز نېيترال pH 32 دىكى مۇسبەت زەرەتلەنگەن ۋە تەرتىپسىز پولىمېرلىق خۇسۇسىيەتكە ئىگە بولغاچقا ، 100 قالدۇق پولى- L-lysine (pLK) نى دەسلەپكى مودېل مولېكۇلا قىلىپ قوللاندۇق. (1b رەسىم) 13C / 15N بەلگىسى بار αS نى ئىشلىتىپ αS: pLK قۇتۇپ نىسبىتى كۆپەيدى.PLK نىڭ αS نىڭ Ct دائىرىسى بىلەن ئۆز-ئارا تەسىر قىلىشى خىمىيىلىك ئۆزگىرىشنىڭ بۇزۇلۇشى ۋە ئاقسىلنىڭ بۇ رايوندىكى چوققا كۈچلۈكلۈكنىڭ تۆۋەنلىشىدە ئىپادىلىنىدۇ.قىزىقارلىق يېرى ، بىز αS قويۇقلۇقىدا αS بىلەن pLK نى ئارىلاشتۇرغاندا.پولىئېتىلېن گلىكول (5-15% PEG-8) نىڭ ئالدىدا 5-25 µM .تامچە فلۇئورېسسېنسىيە (WF) ۋە يورۇق مەيدان (BF) مىكروسكوپ ئارقىلىق كۆزىتىلدى (رەسىم 1c).قويۇقلۇقى αS بولغان 1-5 µm تامچە (1 µM AlexaFluor488 ماركىلىق αS ، AF488-αS قوشۇلغان) تامچە ، ئۇلارنىڭ ئېلېكتىرو سىتاتىك خۇسۇسىيىتى ئۇلارنىڭ% 10 لىك 16xxxedi (1,6-HD) غا بولغان قارشىلىقى ۋە سەزگۈرلۈكىدىن ھاسىل بولىدۇ. NaCl قويۇقلۇقىنىڭ ئېشىشى (رەسىم 1c).SS / pLK ئېلېكتروستاتتىك مۇرەككەپ ماددىنىڭ سۇيۇقلۇققا ئوخشاش خاراكتېرى ئۇلارنىڭ مىللىي سېكۇنت ئىچىدە بىرىكىش ئىقتىدارى بىلەن نامايان بولىدۇ (رەسىم 1d).تۇربىدمېتىرىيە ئارقىلىق ، بىز بۇ شارائىتتا تامچىلىرىنىڭ شەكىللىنىشىنى مىقدارلاشتۇردۇق ، ئۇنىڭ مۇقىملىقى بىلەن مۇناسىۋەتلىك ئاساسلىق ئۆز-ئارا تەسىرنىڭ ئېلېكترو سىتاتىك خۇسۇسىيىتىنى دەلىللىدۇق (1e رەسىم) ، ھەمدە ھەر خىل پولىمېر نىسبىتىنىڭ LLPS جەريانىغا كۆرسەتكەن تەسىرىنى باھالىدۇق (1-رەسىم).گەرچە كۆپ مىقداردا پولىمېر نىسبىتىدە تامچە شەكىللىنىش كۆرۈلگەن بولسىمۇ ، pLK αS دىن ئېشىپ كەتكەندە بۇ جەريان ئىنتايىن پايدىلىق.LLP لار يەنە خىمىيىلىك ئوخشىمىغان يۆتكىلىشچان ۋاكالەتچى dextran-70 (70 kDa) نى ئىشلىتىپ ياكى ئەينەك تام تەسۋىر تامچىسى ، ھەر خىل ماتېرىياللارنىڭ مىكرو تىپتىكى قۇدۇقلىرى ، Eppendorf ياكى كۋارتس قىل قان تومۇرلىرىنى ئۆز ئىچىگە ئالغان ھەر خىل ئەۋرىشكە فورماتلىرىنى ئىشلەتكەن.
بۇ تەتقىقاتتا ئىشلىتىلگەن WT-αS ۋە ΔCt-αS ۋارىيانتلىرىدىكى ئوخشىمىغان ئاقسىل رايونلىرىنىڭ سىخېمالىق ئىپادىلىنىشى.ئاممىياك N تېرمىنال دائىرىسى ، گىدروپوبىك ئامىلوئىد شەكىللەندۈرۈش رايونى (NAC) رايونى ۋە مەنپىي زەرەتلەنگەن C تېرمىنال دائىرىسى ئايرىم-ئايرىم ھالدا كۆك ، قىزغۇچ سېرىق ۋە قىزىل رەڭدە كۆرسىتىلدى.قالدۇق قالدۇق (NCPR) نىڭ WT-αS خەرىتىسى كۆرسىتىلدى.b NMR ماكرو مولېكۇلا توپى بولمىغان ئەھۋال ئاستىدا αS / pLK ئۆز-ئارا تەسىرنى تەھلىل قىلدى.PLK قويۇقلۇقىنىڭ ئېشىشىغا ئەگىشىپ (αS: pLK مولار نىسبىتى ئايرىم-ئايرىم ھالدا سۇس يېشىل ، يېشىل ۋە قېنىق يېشىل رەڭدە كۆرسىتىلدى).c Coacervate αS / pLK (قۇتۇپ نىسبىتى 1:10) 25 µM (1 µM AF488 ماركىلىق αS ياكى WF تەسۋىر ھاسىل قىلىش ئۈچۈن Atto647N ماركىلىق pLK) LLPS بۇففېر (ئۈستى) ياكى 500 mM NaCl (ئاستى سول تەرەپ) ياكى 10 دىن كېيىن تولۇقلىنىدۇ. % 1,6-hexanediol (1,6-HD; ئوڭ تەرەپ ئاستى).كىچىك بالداق = 20 µm.d BF تامچە بىرىكىشىنىڭ ۋەكىللىك مىكروسكوپ تەسۋىرى αS / pLK (قۇتۇپ نىسبىتى 1:10) نىڭ قويۇقلۇقى 25 mMM.يا ئوق يەككە تامچە (قىزىل ۋە سېرىق ئوق) نىڭ 200 ms ئىچىدە يېڭى تامچە (ئاپېلسىن ئوق) نىڭ بىرىكىشىنى كۆرسىتىدۇ.كىچىك بالداق = 20 µm.e نۇر چېچىش (350 nm) LLPS بۇففېردىكى αS / pLK توپلاشنىڭ ئالدى-كەينىدە 500 mM NaCl ياكى 25 µM αS دىكى% 10 1,6-HD (N = 3 ئەۋرىشكە كۆپەيتىلگەن ، ئوتتۇراھال ۋە ئۆلچەملىك ياتلىشىشمۇ كۆرسىتىلدى).f BF تەسۋىرى (ئۈستى) ۋە نۇر چېچىش ئانالىزى (350 nm ، ئاستى)كىچىك بالداق = 10 µm.بىر رەسىمدىكى ئۆلچەم بالدىقى بىر تاختىدىكى بارلىق رەسىملەرنىڭ كۆلىمىنى كۆرسىتىدۇ.خام سانلىق مەلۇمات خام ماتېرىيال ھۆججىتى شەكلىدە تەمىنلەنگەن.
بىزنىڭ αS / pLK ئېلېكتروستاتتىك مۇرەككەپ قويۇقلۇقى ۋە ئىلگىرىكى αS نىڭ tau / RNA قويۇقلۇقىنىڭ خېرىدارلار مولېكۇلاسى سۈپىتىدە كۆزىتىشىمىزگە ئاساسەن ، tau31 بىلەن بىۋاسىتە ئۆز-ئارا تەسىر قىلىش ئارقىلىق ، بىز αS بىلەن تاۋنىڭ RNA بولمىغان ئەھۋال ئاستىدا ئېرىتكۈچى بىلەن ئورتاق ئايرىلىدىغانلىقىنى پەرەز قىلدۇق. قويۇقلاشتۇرۇش.ئېلېكتىروستاتىك مۇرەككەپ ماددىلار ئارقىلىق ، αS بولسا αS / Tau كوئوردېناتلىرىدىكى ئاقسىل ئاقسىل (2e رەسىمدىكى تاۋ توكنىڭ تارقىلىشىغا قاراڭ).بىز LLPS بۇففېردا 10 mMM αS ۋە 10 μMM Tau441 (ئايرىم-ئايرىم ھالدا 1 mMM AF488-αS ۋە 1 μM Atto647N-Tau نى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ) ئارىلاشتۇرۇلغاندا ، ئۇلار WF مىكروسكوپتا كۆرگەندەك ئاسانلا ئاقسىلنى ئۆز ئىچىگە ئالغان ئاقسىل بىرىكمىسىنى ھاسىل قىلغانلىقىنى بايقىدۇق.(2a رەسىم).تامچە ئىچىدىكى ئىككى خىل ئاقسىلنىڭ بىرىكىشى كونفېرانس (CF) مىكروسكوپ ئارقىلىق ئىسپاتلاندى (قوشۇمچە رەسىم 1a).بۇ خىل قىلمىش dextran-70 توپلاش ۋاكالەتچىسى سۈپىتىدە ئىشلىتىلگەندە كۆرۈلگەن (قوشۇمچە رەسىم 1c).FITC بەلگىسى قويۇلغان PEG ياكى dextran نى ئىشلىتىپ ، توپلانغان ھەر ئىككى ۋاكالەتچىنىڭ ئەۋرىشكە ھالقىسىدا تەكشى تەقسىملەنگەنلىكىنى بايقىدۇق ، بۇ يەردە ئايرىمچىلىقمۇ ، ئۇيۇشمامۇ يوق (قوشۇمچە رەسىم 1d).ئەكسىچە ، بۇ سىستېمىدا ئۇلارنىڭ ماكرو مولېكۇلا توپلاش ئۈنۈمى ئارقىلىق فازا ئايرىشنى ئىلگىرى سۈرىدىغانلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ ، چۈنكى PEG باشقا LLP سىستېمىسىدا كۆرسىتىلگەندەك ، مۇقىم مۇقىم ئادەم توپلاش ۋاكالەتچىسى.بۇ ئاقسىل مول تامچىلار NaCl (1 M) غا سەزگۈر ، ئەمما 16-HD (% 10 v / v) ئەمەس ، ئۇلارنىڭ ئېلېكتر سىتاتىك خۇسۇسىيىتىنى ئىسپاتلايدۇ (قوشۇمچە 2a رەسىم ، b).ئۇلارنىڭ سۇيۇقلۇق ھەرىكىتى BF مىكروسكوپ ئارقىلىق مىللىمېتىر سېكۇنت بىرلەشتۈرۈش تامچىلىرىنى كۆزىتىش ئارقىلىق ئىسپاتلاندى (2b رەسىم).
LLPS بۇففېردىكى αS / Tau441 ماسلاشتۇرغۇچنىڭ Confocal (CF) مىكروسكوپ تەسۋىرى (ھەر بىر ئاقسىلنىڭ 10 μMM ، AF488 ماركىسىدىكى 0.5 μM ۋە Atto647N ماركىلىق Tau441).b αS / Tau441 تامچە بىرىكىش ھادىسىسىنىڭ ۋەكىللىك پەرقلىق ئارىلىشىش سېلىشتۇرمىسى (DIC) رەسىملىرى (ھەر بىر ئاقسىل ئۈچۈن 10 mMM).c Tau441 LLPS (0-15 µM) يورۇقلۇق چېچىلىشنى ئاساس قىلغان باسقۇچلۇق دىئاگرامما 50 µM αS بولمىغان (سولدا) ياكى مەۋجۇت (ئوڭدا).ئىللىق رەڭلەر تېخىمۇ كۆپ چېچىلىشنى كۆرسىتىدۇ.d αS / Tau441 LLPS ئەۋرىشكىسىنىڭ نۇر چېچىشى αS قويۇقلۇقى ئېشىپ (Tau441 5 µM ، N = 2–3 ئەۋرىشكە تەكرارلانغان).e بۇ تەتقىقاتتا ئىشلىتىلگەن بىر قىسىم تاۋ ئاقسىلنىڭ ۋارىيانتلىرى ۋە ئاقسىلنىڭ ئوخشىمىغان رايونلىرىنىڭ سىخېمالىق ئىپادىلىنىشى: سەلبىي زەرەتلەنگەن N تېرمىنال دائىرىسى (قىزىل) ، مول مول رايون (كۆك) ، مىكرو قۇتۇب باغلاش دائىرىسى (MTBD ، ئاپېلسىندا گەۋدىلىنىدۇ) ۋە ئامىلوئىد ھاسىل قىلىدىغان جۈپ ئايلانما.MTBD (كۈلرەڭ) ئىچىگە جايلاشقان ئىنچىكە رايونلار (PHF).Tau441 نىڭ قالدۇق قالدۇق ھەققى (NCPR) خەرىتىسى كۆرسىتىلدى.f 1 µM AF488 بەلگىسى قويۇلغان αS ۋە Atto647N ماركىلىق ΔNt- نى ئىشلىتىپ ، 1 µM AF488 ماركىلىق αS ياكى ΔCt-αS نى ئىشلىتىپ ΔNt-Tau (ئۈستۈنكى ئاقسىل 10 µM) ياكى K18 (ئاستى ، ئاقسىل 50 µM) ))) LLPS ياكى K18 بۇففېردا قويۇقلاشتۇرۇلغان WF نىڭ مىكروگرافىيىسى.بىر رەسىمدىكى ئۆلچەم بالدىقى بىر تاختايدىكى بارلىق رەسىملەرنىڭ كۆلىمىگە ۋەكىللىك قىلىدۇ (a, b ۋە f تاختىلارنىڭ 20 µm).C ۋە d تاختىسىنىڭ خام ماتېرىياللىرى خام ماتېرىيال ھۆججىتى سۈپىتىدە تەمىنلەنگەن.
بۇ LLPS جەريانىدىكى αS نىڭ رولىنى سىناش ئۈچۈن ، بىز ئالدى بىلەن NaCl نىڭ قويۇقلۇقىنى ئاشۇرۇش ئارقىلىق نېفېلومېتىرىيە ئارقىلىق αS نىڭ تامچە مۇقىملىقىغا بولغان تەسىرىنى تەكشۈردۇق (2c رەسىم).ئەۋرىشكە تەركىبىدىكى αS تەركىبىدىكى تۇز قويۇقلۇقى قانچە يۇقىرى بولسا ، نۇر چېچىش قىممىتى شۇنچە يۇقىرى بولىدۇ (350 nm) ، بۇ αS نىڭ بۇ LLPS سىستېمىسىدىكى مۇقىملاشتۇرۇش رولىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ.مۇشۇنىڭغا ئوخشاش ئۈنۈمنى αS قويۇقلۇقى (شۇڭلاشقا αS: Tau441 نىسبىتى) نى ئاشۇرۇش ئارقىلىق كۆرگىلى بولىدۇ.تاۋ قويۇقلۇقى (5 µM) غا سېلىشتۇرغاندا 10 ھەسسە ئاشۇرۇش (2d رەسىم).SS نىڭ كوئوردېنات تەركىبىدىكى ئاقسىل ئىكەنلىكىنى ئىسپاتلاش ئۈچۈن ، بىز LLPS قالايمىقانلاشقان تاۋ ئۆزگىرىشىنىڭ ھەرىكىتىنى تەكشۈرۈشنى قارار قىلدۇق ، ئۇنىڭدا مەنپىي زەرەتلەنگەن N تېرمىنال رايونى (قالدۇقلىرى 1-150 ، 2e رەسىمگە قاراڭ) ΔNt-Tau دەپ ئاتىلىدۇ.WF مىكروسكوپ ۋە نېفېلومېتىرىيە ئىلگىرى خەۋەر قىلىنغاندەك ، ΔNt-Tau نىڭ LLPS (2f رەسىم ۋە قوشۇمچە 2d رەسىم) دىن ئۆتمىگەنلىكىنى دەلىللىدى. ئوخشاش شارائىت ۋە ئاقسىل قويۇقلۇقىدا Tau ۋە αS نىڭ چوڭ رازمېرلىق ئېرىتمىسىنىڭ تامچە زىچلىقىغا يېقىن تامچە زىچلىقى بىلەن ئەسلىگە كەلتۈرۈلدى.تۆۋەن ماكرو مولېكۇلا توپلاشقان شارائىتتا بۇ جەرياننىمۇ كۆرگىلى بولىدۇ (قوشۇمچە 2c رەسىم).LLPS جەريانىدىكى C تېرمىنال αS رايونىنىڭ رولى ، ئەمما ئۇنىڭ پۈتكۈل ئۇزۇنلۇقى ئەمەس ، (ΔCt-) نىڭ 104-140 (قالدۇق رەسىم) C- تېرمىنال كېسىلگەن αS ۋارىيانتى ئارقىلىق تامچە شەكىللىنىشنى چەكلەش ئارقىلىق نامايان بولدى. αS) ئاقسىل (2-رەسىم ۋە قوشۇمچە 2d رەسىم).SS ۋە ΔNt-Tau نىڭ بىرىكتۈرۈلۈشى فوكۇس فلۇئورېسسېنسىيە مىكروسكوپى ئارقىلىق ئىسپاتلاندى (قوشۇمچە رەسىم 1b).
Tau441 بىلەن αS ئارىسىدىكى LLPS مېخانىزمىنى يەنىمۇ سىناش ئۈچۈن ، قوشۇمچە Tau تىپى قوللىنىلدى ، يەنى مىكرو قۇتۇب باغلاش دائىرىسى (MTBD) دىكى جۈپ شەكىللىك خىلىتلىق يادرولۇق بۆلەك (PHF) پارچىسى ، ئەگەر ئۇنىڭدا تۆت خىل تەكرارلىنىدىغان دائىرە بولسا ، ئادەتتە بىلىنىدۇ. K18 پارچىسى سۈپىتىدە (2e رەسىمگە قاراڭ).يېقىندا خەۋەر قىلىنىشىچە ، αS ئەڭ ياخشىسى مىكروبوبىل باغلاش دائىرىسىنىڭ ئالدىدىكى تەرتىپ بويىچە مول مول دائىرىگە جايلاشقان تاۋ ئاقسىلى بىلەن باغلىنىدىكەن.قانداقلا بولمىسۇن ، PHF رايونىدا مۇسبەت زەرەتلەنگەن قالدۇقلارمۇ مول (2e رەسىمگە قاراڭ) ، بولۇپمۇ لىزىن (% 15 قالدۇق) ، بۇ بىزنى بۇ رايوننىڭ αS / Tau مۇرەككەپلىكىنىڭ قويۇقلىشىشىغا تۆھپە قوشقان-قوشمىغانلىقىنى سىناشقا ئۈندىدى.بىز پەقەت K18 نىڭلا سىناق قىلىنغان شارائىتتا قويۇقلۇقى 100 μMM بولغان LLPS نى قوزغىتالمايدىغانلىقىنى بايقىدۇق (LLPS بۇففېر% 15 PEG ياكى% 20 لىك دېسران) (2f رەسىم).قانداقلا بولمىسۇن ، 50 µM K18 غا 50 µM αS نى قوشقاندا ، نېفېلومېتىرىيە (قوشۇمچە 2d رەسىم) ۋە WF مىكروسكوپ ئارقىلىق K18 ۋە αS بولغان ئاقسىل تامچىلىرىنىڭ تېز شەكىللىنىشى كۆرۈلدى (2f رەسىم).ئويلىغىنىدەك ، ΔCt-αS K18 نىڭ LLPS ھەرىكىتىنى ئەسلىگە كەلتۈرەلمىدى (رەسىم 2f).بىز شۇنىڭغا دىققەت قىلىمىزكى ، αS / ΔNt-Tau ياكى αS / Tau441 غا سېلىشتۇرغاندا ، LLS نى قوزغىتىش ئۈچۈن αS / K18 نىڭ توپلىنىشى سەل يۇقىرى ئاقسىل قويۇقلۇقىنى تەلەپ قىلىدۇ.بۇ ئىلگىرى 31-تەسۋىرلەنگەندەك ، مىكروبىلوگ باغلاش دائىرىسىگە سېلىشتۇرغاندا ، αS C تېرمىنال رايونىنىڭ مول مول بولغان Tau تور نامىنىڭ كۈچلۈك ئۆز-ئارا تەسىر قىلىشى بىلەن بىردەك.
NNt-Tau αS بولمىغان ئەھۋال ئاستىدا LLPS نى ئورۇندىيالمايدىغانلىقىنى كۆزدە تۇتۇپ ، بۇ Tau نۇسخىسىنى پۈتۈن ئۇزۇنلۇقتىكى Tau (ئىزوتوپ ، Tau441 / Tau441) بىلەن LLPS سىستېمىسىدىكى ئاددىيلىقىنى كۆزدە تۇتۇپ ، αS / Tau LLPS نى خاراكتېرلەندۈرۈشنىڭ ئۈلگىسى قىلىپ تاللىدۇق.مۇرەككەپ (گېروتىپ تىپىك ، αS / Tau441) توپلاش جەريانى بىلەن.بىز αS / Tau ۋە αS / ΔNt-Tau سىستېمىسىدىكى αS توپلاش دەرىجىسىنى (قويۇق فازا ئاقسىلىنىڭ بىر قىسمى سۈپىتىدە ، fαS ، c) سېلىشتۇرۇپ ، تارقاقلاشتۇرۇلغان SDS-PAGE ئانالىزى (2e گە قاراڭ) نى بايقىدۇق. ئوخشاش قويۇقلۇقتىكى بارلىق ئاقسىللار ئۈچۈن.بولۇپمۇ بىز αS / Tau ۋە αS / ΔNt-Tau ئۈچۈن ئايرىم-ئايرىم ھالدا fαS ، c 84 ± 2% ۋە 79 ± 7% گە ئېرىشتۇق ، بۇ αS بىلەن تاۋ ئوتتۇرىسىدىكى يات جىسىمنىڭ ئۆز-ئارا تەسىر قىلىشىنىڭ تاۋ مولېكۇلاسىنىڭ ئۆز-ئارا تەسىر كۆرسىتىشىدىن ئۈستۈن ئىكەنلىكىنى ئوتتۇرىغا قويدۇق.between.
ھەر خىل كۆپ قۇتۇپلىشىشلار بىلەن ئۆز-ئارا تەسىر كۆرسىتىش ۋە قويۇقلىشىش جەريانىنىڭ αS ھەرىكەتلىرىگە بولغان تەسىرى ئالدى بىلەن فوتوئاكتىپلىق نۇر (FRAP) ئۇسۇلىدىن كېيىن فلۇئورېسسېنسىيەنىڭ ئەسلىگە كېلىشى تەرىپىدىن تەتقىق قىلىنغان.بىز αS / Tau441 ، αS / ΔNt-Tau ۋە αS / pLK ماسلاشتۇرغۇچنى سىنىدۇق (100 μM αS 2 μM αS AF488-αS ۋە 100 μM Tau441 ياكى ΔNt-Tau ياكى 1 mM pLK).ئەۋرىشكە زاپچاسلىرىنى ئارىلاشتۇرغاندىن كېيىنكى 30 مىنۇت ئىچىدە سانلىق مەلۇماتقا ئېرىشتى.ۋەكىللىك FRAP رەسىملىرىدىن (3a رەسىم ، αS / Tau441 قويۇقلۇقى) ۋە ئۇلارنىڭ ماس كېلىدىغان ۋاقىت ئەگرى سىزىقى (3b رەسىم ، قوشۇمچە 3-رەسىم) دىن شۇنى كۆرۈۋېلىشقا بولىدۇكى ، αS ھەرىكەتلىرى Tau441 كوئوردېناتلىرى بىلەن ناھايىتى ئوخشايدۇ.ۋە tNt-Tau ، بۇ pLK بىلەن تېخىمۇ تېز.FRAP غا ئاساسەن كوكسېرت ئىچىدىكى αS نىڭ ھېسابلانغان تارقىلىش كوئېففىتسېنتى (كاڭ قاتارلىقلار تەرىپىدىن تەسۋىرلەنگەندەك) D = 0.013 ± 0.009 µm2 / s ۋە D = 0.026 ± 0.008 µm2 / s αS / Tau441 ۋە αS / ΔNt- ئۈچۈن αS / سىستېما.pLK, Tau, and D = 0.18 ± 0.04 µm2 / s (3c رەسىم).قانداقلا بولمىسۇن ، تارقاق باسقۇچتىكى تارقىلىش كوئېففىتسېنتى αS بارلىق قويۇق باسقۇچلارغا قارىغاندا بىر قانچە چوڭلۇقتىكى زاكاز بولۇپ ، فلۇئورېسسېنسىيە باغلىنىشلىق سپېكتروسكوپى (FCS ، قوشۇمچە 3-رەسىمگە قاراڭ) ئوخشاش شارائىتتا (LLPS بۇففېر) ، ئەمما كۆپ قۇتۇپلىشىش بولمىغان ئەھۋال ئاستىدا. (D = 8 ± 4 µm2 / s).شۇڭلاشقا ، مولېكۇلا توپلاش ئۈنۈمى سەۋەبىدىن تارقاق باسقۇچتىكى ئاقسىلغا سېلىشتۇرغاندا ، αS تەرجىمىسىنىڭ ھەرىكەتچانلىقى كۆرۈنەرلىك تۆۋەنلەيدۇ ، گەرچە بارلىق كوكراتلار شەكىللەنگەندىن كېيىنكى ئالدىنقى يېرىم سائەتتە سۇيۇقلۇققا ئوخشاش خۇسۇسىيەتلەرنى ساقلاپ قالىدۇ ، گەرچە تاۋ باسقۇچىغا سېلىشتۇرغاندا.pLK قويۇقلۇقىدىكى تېخىمۇ تېز ھەرىكەت.
a - c FRAP ئېلېكتىروستاتىك كوئوردېناتتىكى αS دىنامىكىسى (% 2 AF488 بەلگىسى بار αS) نى ئانالىز قىلىش.ئۈچ خىل شەكىلدىكى αS / Tau441 FRAP نىڭ ۋەكىللىك رەسىملىرى (a) دا كۆرسىتىلدى ، بۇ يەردە قىزىل چەمبىرەك بېزەلگەن رايونلارنى كۆرسىتىدۇ.كۆلەم بالداق 5 µm.b ئوتتۇرىچە FRAP ئەگرى سىزىقى ۋە (c) ھېسابلانغان تارقىلىشچان كوئېففىتسېنت (D) ئۈچ خىل تەجرىبىدىن 100 µM αS ۋە Tau441 (قىزىل) ياكى ΔNt-Tau (كۆك) ياكى pLK (يېشىل) دىن ئىبارەت. LLPS نىڭ قويۇقلۇقى ئون ھەسسە.FRAP ئەگرى سىزىقىنىڭ ئۆلچەملىك ئايلىنىشى سايە رەڭدە كۆرسىتىلدى.سېلىشتۇرۇش ئۈچۈن ، تارقاق باسقۇچتىكى تارقىلىش كوئېففىتسېنتى αS فلۇئورېسسېنسىيە باغلىنىشلىق سپېكتروسكوپ (FCS) ئارقىلىق ئۈچ ھەسسە بېكىتىلدى (قوشۇمچە 3-رەسىم ۋە تېخىمۇ كۆپ ئۇچۇرلارنىڭ ئۇسۇللىرىغا قاراڭ).d LLPS بۇففېردا 100 μM TEMPOL-122-αS لىك ئۈزلۈكسىز X بەلۋاغ EPR سپېكترى ھېچقانداق پولىسىيلاش (قارا) ياكى 100 μ mM Tau441 (قىزىل) ياكى ΔNt-Tau (كۆك) ياكى 1 mM pLK (يېشىل).بۇ قىستۇرما ئەڭ كەسكىن ئۆزگىرىش يۈز بېرىدىغان كۈچلۈك مەيدان لىنىيىسىنىڭ چوڭايتىلغان كۆرۈنۈشىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ.e LLPS بولمىغان ئەھۋالدا (PEG يوق) 50 μM TEMPOL-122-αS نىڭ ئەگرى سىزىقلىرى.نورماللاشقان EPR سپېكترىنىڭ II (IIII / III) گە سېلىشتۇرغاندا III گۇرۇپپىنىڭ ئامپلتۇدىسىنىڭ تۆۋەنلىشى Tau441 (قىزىل) ، ΔNt-Tau (كۆك) ۋە pLK (يېشىل) نىڭ قۇتۇپ نىسبىتىنى ئاشۇرۇۋېتىدىغانلىقى كۆرسىتىلدى.رەڭلىك سىزىقلار ھەر بىر ئەگرى سىزىقتىكى n ئوخشاش ۋە مۇستەقىل باغلىنىشلىق تور بېكەتلەر بىلەن قوپال باغلىنىش ئەندىزىسىنى ئىشلىتىپ سانلىق مەلۇماتلارغا ماس كېلىدىغانلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ.خام سانلىق مەلۇمات خام ماتېرىيال ھۆججىتى شەكلىدە تەمىنلەنگەن.
بىز تولۇقلاش سۈپىتىدە ، يۆنىلىشلىك ئايلانما بەلگە (SDSL) ۋە ئۈزلۈكسىز ئېلېكترون پاراماگنىتلىق رېزونانىس (CW-EPR) ئارقىلىق ھەر خىل كوئوردېناتتىكى αS نىڭ ھەرىكەتچانلىقىنى تەكشۈردۇق.بۇ ئۇسۇل IDP نىڭ جانلىقلىقى ۋە ھەرىكەتچانلىقىنى ھەقىقىي قالدۇق ئېنىقلىق دەرىجىسى 36،37،38 دوكلات قىلىشتا ئىنتايىن پايدىلىق ئىكەنلىكى ئىسپاتلاندى.بۇنىڭ ئۈچۈن بىز يەككە Cys ئۆزگەرتكۈچىدە سىستايىن قالدۇقى ياساپ ، 4-گىدروكىسسى -2،2،6،6-تېترامېتىلپىپېرىدىن- N- ئوكسىد (TEMPOL) ئايلانما تەكشۈرۈش ئەسۋابىنى ئىشلەتتۇق.Maleimide تۇخۇمى ئۇلارغا بەلگە بېرىدۇ.تېخىمۇ ئېنىق قىلىپ ئېيتقاندا ، بىز TEMPOL تەكشۈرۈش ئەسۋابىنى 122 ياكى 24 αS (TEMPOL-122-αS ۋە TEMPOL-24-αS) ئورۇنغا قىستۇردۇق.بىرىنچى خىل ئەھۋالدا ، بىز ئاقسىلنىڭ C تېرمىنال رايونىنى نىشانلايمىز ، ئۇ كۆپ قۇتۇپلىشىش بىلەن ئۆز-ئارا تەسىر كۆرسىتىدۇ.ئەكسىچە ، 24-ئورۇن بىزگە قويۇق ھالەتتىكى ئاقسىلنىڭ ئومۇمىي ھەرىكەتچانلىقى ھەققىدە ئۇچۇر بېرەلەيدۇ.ھەر ئىككى خىل ئەھۋال ئاستىدا ، تارقاق باسقۇچتىكى ئاقسىللارغا ئېرىشكەن EPR سىگنالى تېز ھەرىكەتلىنىدىغان ھالەتتىكى نىتروكسىد رادىكاللىرىغا ماس كېلىدۇ.Tau ياكى pLK (100 μ mM TEMPOL-αS ، Tau441 ياكى ΔNt-Tau نىڭ نىسبىتى 1: 1 ياكى pLK نىسبىتى 1:10 نىسبەتتە) باسقۇچلۇق ئايرىلغاندىن كېيىن ، نىسپىي چوققا كۈچلۈكلۈكنىڭ ئېشىشىدا كۆرۈلگەن. αR نىڭ EPR سپېكترى.زىيان سىزىقى كېڭىيىپ ، سۇيۇقلۇق باسقۇچىدىكى ئاقسىلغا سېلىشتۇرغاندا ، تامچە αS يۆنىلىشنىڭ ھەرىكەتلىنىش نىسبىتىنىڭ تۆۋەنلىگەنلىكىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ (3d رەسىم ، قوشۇمچە 4a رەسىم).بۇ ئۆزگىرىشلەر 122-ئورۇندا تېخىمۇ روشەن ئىپادىلىنىدۇ. 24-ئورۇندا pLK نىڭ بولۇشى تەكشۈرۈش ئەسۋابىغا تەسىر كۆرسەتمىگەن بولسىمۇ ، 122-ئورۇندا سپېكترى سىزىق شەكلى كۆرۈنەرلىك ئۆزگەردى (قوشۇمچە 4a رەسىم).بىز ئايلانما بەلگە IDP38,39 نىڭ ھەرىكەتچانلىقىنى تەسۋىرلەشكە ئىشلىتىلىدىغان ئىزوتوپرو مودېل (قوشۇمچە 5a رەسىم) ئارقىلىق ئىككى αS / كۆپ قۇتۇپلۇق سىستېمىنىڭ 122-ئورنىدا سپېكترىنى ئۈلگە قىلماقچى بولغاندا ، تەجرىبە سپېكترىنى قايتا قۇرالمىدۇق..24 ئايلانما ئورۇننىڭ سپېكترا تەقلىد قىلىنىشى سېلىشتۇرما (قوشۇمچە 5a رەسىم).بۇ C تېرمىنال رايونىنىڭ αS رايونىنىڭ ئايلانما سەپلىمىسى بوشلۇقىدا كۆپ قۇتۇپلىشىش ئالدىدا ئەۋزەل ئورۇنلارنىڭ بارلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ.تەجرىبە EPR شارائىتىدا قويۇق باسقۇچتىكى αS نىڭ بۆلەكلىرىنى ئويلاشقاندا (αS / Tau441 ، αS / ΔNt-Tau ۋە αS / pLK نىڭ ئايرىم-ئايرىم ھالدا 84 ± 2% ، 79 ± 7% ۋە 47 ± 4%). 2-رەسىم سانلىق مەلۇمات ئانالىزى c) ، بۇنىڭدىن كۆرۈۋېلىشقا بولىدۇكى ، EPR ئۇسۇلى ئارقىلىق بايقالغان كېڭەيتىش ئاساسلىقى C تېرمىنال رايونى αS نىڭ قويۇق باسقۇچتىكى ھەر خىل كۆپ قۇتۇپلىشىش بىلەن ئۆز-ئارا تەسىر كۆرسىتىشىنى ئەكىس ئەتتۈرىدۇ (TEMPOL-122- نى ئىشلەتكەندە ئاساسلىق ئۆزگىرىش) αS) ، ئاقسىل قويۇقلۇقى ئەمەس.تەكشۈرۈشتە مىكرو ۋىرۇسنىڭ كۆپىيىشى كۆرۈلىدۇ.ئويلىغىنىدەك ، LLPS دىن باشقا شارائىتتا ئاقسىلنىڭ EPR سپېكترى ئارىلاشمىغا 1 M NaCl قوشۇلغاندا پۈتۈنلەي ئەسلىگە كەلگەن (قوشۇمچە 4b رەسىم).ئومۇمىي جەھەتتىن ئالغاندا ، بىزنىڭ سانلىق مەلۇماتلىرىمىز CW-EPR بايقىغان ئۆزگىرىشلەرنىڭ ئاساسلىقى C تېرمىنال رايونىنىڭ αS نىڭ قويۇق باسقۇچتىكى ھەر خىل كۆپ قۇتۇپلىشىش بىلەن ئۆز-ئارا تەسىر كۆرسىتىدىغانلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ ، بۇ خىل ئۆز-ئارا تەسىر تاكتىكىغا قارىغاندا pLK بىلەن تېخىمۇ كۈچلۈكتەك قىلىدۇ.
كوئوردېناتتىكى ئاقسىلغا مۇناسىۋەتلىك تېخىمۇ كۆپ قۇرۇلمىلىق ئۇچۇرلارغا ئېرىشىش ئۈچۈن ، بىز ھەل قىلىش چارىسىدە NMR ئارقىلىق LLPS سىستېمىسىنى تەتقىق قىلىشنى قارار قىلدۇق.قانداقلا بولمىسۇن ، بىز پەقەت تارقاق باسقۇچتا قالغان αS بۆلەكلىرىنىلا بايقىيالايمىز ، بۇ بەلكىم كوكراتنىڭ ئىچىدىكى ئاقسىلنىڭ ھەرىكەتچانلىقىنىڭ تۆۋەنلىشى ۋە NMR تەھلىلىدىكى ھەل قىلىش چارىسىنىڭ ئاستىدىكى قويۇق باسقۇچتىن بولۇشى مۇمكىن.بىز NMR ئارقىلىق LLPS ئەۋرىشكىسىنىڭ تارقاق باسقۇچىدا قالغان ئاقسىلنىڭ قۇرۇلمىسى ۋە ھەرىكەتچانلىقىنى تەھلىل قىلغىنىمىزدا ، ئاقسىلنىڭ pLK ۋە ΔNt-Tau نىڭ ئالدىدا ئاساسەن ئوخشاش ھەرىكەت قىلغانلىقىنى بايقىدۇق. ئىككىلەمچى خىمىيىلىك ئۆزگىرىش ۋە R1ρ بوشىشىش تەجرىبىسى ئارقىلىق ئاشكارلانغان ئاقسىل ئومۇرتقىسىنىڭ ئىككىنچى قۇرۇلمىسى ۋە ھەرىكەتچانلىقىدا.NMR سانلىق مەلۇماتلىرىدا كۆرسىتىلىشىچە ، αS نىڭ C تېرمىنالى كۆپ قۇتۇپلۇق ئۆز-ئارا تەسىر كۆرسەتكەنلىكتىن ، باشقا ئاقسىل تەرتىپىگە ئوخشاش تەرتىپسىزلىكىنى ساقلاپ قېلىش بىلەن بىرگە ماسلىشىشچانلىقىنى كۆرۈنەرلىك يوقىتىدىكەن.
TEMPOL-122-αS قويۇق باسقۇچتا كۆزىتىلگەن CW-EPR سىگنالىنىڭ كېڭىيىشى ئاقسىلنىڭ كۆپ قۇتۇپلىشىش بىلەن ئۆز-ئارا تەسىر كۆرسىتىشىنى ئەكس ئەتتۈرىدىغان بولغاچقا ، بىز EPR ماۋزۇسىنى ئىشلەپ ، LLPS بولمىغان ئەھۋال ئاستىدا αS نىڭ ھەر خىل كۆپ قۇتۇپلۇققا باغلىنىشچانلىقىنى باھالىدۇق. بۇففېر LLPS) ، سۇيۇق ۋە مەركەزلىك باسقۇچتا ئۆز-ئارا تەسىرنىڭ ئوخشاش بولىدىغانلىقىنى ئوتتۇرىغا قويدى (بۇ بىزنىڭ سانلىق مەلۇماتلىرىمىز تەرىپىدىن دەلىللەنگەن ، قوشۇمچە 4a رەسىم ۋە قوشۇمچە 6-رەسىم).بۇنىڭدىكى مەقسەت بارلىق سۇيۇقلۇقلارنىڭ ئورتاق سۇيۇقلۇققا ئوخشاش خۇسۇسىيىتىگە قارىماي ، مولېكۇلا سەۋىيىسىدىكى يوشۇرۇن پەرقلىق ھەرىكەتلەرنى نامايان قىلىش-كۆرسەتمەسلىكىنى كۆرۈش ئىدى.ئويلىغىنىدەك ، EPR سپېكترى كۆپ قۇتۇپلىشىشنىڭ قويۇقلۇقىنىڭ كېڭىيىشى بىلەن كېڭىيىپ ، بارلىق ئۆز-ئارا ھەمكارلىق شېرىكلىرىنىڭ تويۇنۇشقا ئاز قالغانلىقى ئۈچۈن مولېكۇلا جانلىقلىقىنىڭ تۆۋەنلىگەنلىكىنى ئەكس ئەتتۈردى (3e رەسىم ، قوشۇمچە 6-رەسىم).pLK بۇ تويۇنۇشنى ΔNt-Tau ۋە Tau441 غا سېلىشتۇرغاندا تۆۋەنرەك قۇتۇپ نىسبىتىدە (كۆپ قۇتۇپلىشىش: αS) ئەمەلگە ئاشۇردى.ئەمەلىيەتتە ، سانلىق مەلۇماتلارنى ئوخشاش باغلىنىشلىق ۋە مۇستەقىل باغلىنىشلىق تور بېكەت دەپ پەرەز قىلغان سانلىق مەلۇماتنى سېلىشتۇرۇشتا كۆرسىتىلىشىچە ، pLK (~ 5 μ mM) نىڭ ئايرىلىش تۇراقلىقى Tau441 ياكى ΔNt-Tau (~ 50 μMM) دىن تۆۋەن بولغان تەرتىپ. ).µM).گەرچە بۇ بىر تەخمىنىي مۆلچەر بولسىمۇ ، ئەمما بۇ αS نىڭ ئۇدا مۇسبەت زەرەتلەش رايونلىرى بىلەن تېخىمۇ ئاددىي كۆپ قۇتۇپقا بولغان يېقىنلىقىنىڭ بارلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ.SS بىلەن ھەر خىل كۆپ قۇتۇپلىشىشنىڭ يېقىنلىقىدىكى بۇ پەرقنى كۆزدە تۇتۇپ ، بىز ئۇلارنىڭ سۇيۇقلۇق خۇسۇسىيىتىنىڭ ۋاقىتنىڭ ئۆتۈشىگە ئەگىشىپ باشقىچە ئۆزگىرىشى مۇمكىنلىكىنى ، شۇڭا ئوخشىمىغان LSPT جەريانلىرىغا دۇچار بولىدىغانلىقىنى پەرەز قىلدۇق.
ئاقسىل كوئوردېنات تەركىبىدىكى ئادەم كۆپ بولغان مۇھىت ۋە ئاقسىلنىڭ ئامىلوئىد خاراكتېرىنى كۆزدە تۇتۇپ ، ۋاقىتنىڭ ئۆتۈشىگە ئەگىشىپ كوكۇسنىڭ ھەرىكىتىنى كۆزىتىپ ، LSPT جەريانلىرىنى بايقىدۇق.BF ۋە CF مىكروسكوپنى ئىشلىتىپ (4-رەسىم) ، بىز αS / Tau441 نىڭ كۆپ مىقداردا ھەل قىلىش چارىسىنى بىرلەشتۈرۈپ ، قۇدۇقنىڭ ئاستىدىكى يەر يۈزى بىلەن ئۇچراشقان ۋە ھۆل بولۇپ كەتكەن چوڭ تامچىلارنى شەكىللەندۈرگەنلىكىنى بايقىدۇق (قوشۇمچە رەسىم) 7d);بىز بۇ تۆۋەنكى قۇرۇلمىلارنى «ئاقسىل ئوق» دەپ ئاتايمىز.بۇ قۇرۇلمىلار سۇيۇق ھالەتتە ساقلانغان بولۇپ ، ئۇلار بىرىكىش ئىقتىدارىنى ساقلاپ قالغان (قوشۇمچە 7b رەسىم) ، LLPS قوزغالغاندىن كېيىن بىر نەچچە سائەت كۆرگىلى بولىدۇ (4-رەسىم ۋە قوشۇمچە 7-رەسىم).بىز ھۆللۈك جەريانىنىڭ گىدروفوبىك ماتېرىيالىغا ئەمەس ، بەلكى گىدروفىللىق يۈزىگە مايىل ئىكەنلىكىنى بايقىدۇق (قوشۇمچە 7-رەسىم)تىلغا ئېلىشقا ئەرزىيدىغىنى ، αS / ΔNt-Tau نىڭ ئۇيۇشۇش كۈچى ۋە تارتىشىش كۆرۈنەرلىك ئازايدى ، αS / pLK قويۇقلۇقى كۆرۈنەرلىك ئازايدى (4-رەسىم).قىسقا يوشۇرۇن دەۋرىدە ، αS / pLK تامچىلىرى سۇيۇقلاندۇرۇلغان يەر يۈزىنى بىرلەشتۈرەلەيدۇ ۋە ھۆل قىلالايدۇ ، ئەمما بۇ جەريان تېزلا توختاپ ، 5 سائەت يوشۇرۇنغاندىن كېيىن ، پەقەت چەكلىك ئۇيۇشۇش ھادىسىسى ۋە ھۆللۈك كۆرۈلمىگەن.- گېلى تامچە ئۆتۈش.
ۋەكىل BF (يېشىل رەڭلىك تاختاي) ۋە CF (ئوڭ تەرەپتىكى تاختاي ، يېشىل رەڭدىكى AF488 بەلگىسى بار αS) LLPS بۇففېردا 100 µM Tau441 (ئۈستى) فلۇئورېسسېنسىيە) مىكروسكوپلۇق رەسىملەر بار. -تاۋ (ئوتتۇرىدا) ياكى 1 mM pLK (ئاستى) ئوخشىمىغان يوشۇرۇن دەۋرى ۋە فوكۇس ئېگىزلىكى (z ، تەخسىنىڭ ئاستى بىلەن بولغان ئارىلىقى).بۇ سىناقلار ئوخشاش نەتىجىگە ئېرىشكەن ھالدا بىر-بىرىدىن مۇستەقىل ھالدا 4-6 قېتىم تەكرارلانغان.αS / Tau441 ماسلاشتۇرغۇچ 24 سائەتتىن كېيىن ھۆل بولۇپ ، رەسىمدىن چوڭ ئوق ھاسىل قىلىدۇ.بارلىق رەسىملەرنىڭ ئۆلچەم بالدىقى 20 µm.
ئاندىن بىز αS / Tau441 LLPS دا شەكىللەنگەن چوڭ سۇيۇقلۇققا ئوخشاش ئاقسىل كۆلچەكلىرىنىڭ تەتقىق قىلىنغان ئاقسىللارنىڭ ئامىلوئىد يىغىلىشىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدىغانلىقىنى سورىدۇق.بىز يۇقىرىدىكىگە ئوخشاش شارائىتتا WF مىكروسكوپ بىلەن ۋاقىتنىڭ ئۆتۈشىگە ئەگىشىپ αS / Tau441 تامچىلىرىنىڭ يېتىلىشىگە ئەگىشىپ ماڭدۇق ، ئەمما 1 μM AF488 ماركىلىق αS ۋە Atto647N ماركىلىق Tau441 نى ئىشلەتتۇق (5a رەسىم).ئويلىغىنىمىزدەك ، بىز يېتىلىش جەريانىدا تولۇق ئاقسىلنىڭ يەرلىكلەشتۈرۈلۈشىنى كۆردۇق.قىزىقارلىق يېرى ، ك.5 سائەتتىن كېيىن ، سالنىڭ ئىچىدە تېخىمۇ كۈچلۈك ئايلانما بولمىغان قۇرۇلمىلار كۆرۈلدى ، بىز بۇنى «نۇقتا» دەپ ئاتايمىز ، ئۇلارنىڭ بەزىلىرى αS بىلەن بىرىكتۈرۈلگەن ، بەزىلىرى Tau441 دا بېيىغان (5a رەسىم ، ئاق ئوق).بۇ داغلار ئەزەلدىن αS / ΔNt-Tau غا قارىغاندا αS / ΔNt-Tau غا نىسبەتەن تېخىمۇ كۆپ دائىرىدە بايقالغان.PLK ۋە Tau سىستېمىسىنىڭ تامچىلىرىدا بىرىكىش / ھۆللۈككە ماس كەلمەيدىغان ئالاھىدە نۇقتىلار يوق.SS ۋە Tau441 بولغان بۇ داغلارنىڭ ئامىلوئىدقا ئوخشايدىغان توپلام ياكى ئەمەسلىكىنى سىناش ئۈچۈن ، بىز CF مىكروسكوپ ئارقىلىق ئوخشاش سىناقنى ئېلىپ باردۇق ، بۇنىڭدا Tau441 غا Atto647N ۋە 12.5 μ mM لىك ئامىلوئىدقا خاس تىئوفلاۋىن- T (ThT) قوشۇلدى.dye.گەرچە αS / Tau441 تامچىسى ياكى ئوقنىڭ ThT دا داغلىنىشى 24 سائەت يوشۇرۇنغاندىن كېيىنمۇ كۆرۈلمىگەن (5b رەسىم ، ئۈستۈنكى قۇر - ئاقسىل ئوقنىڭ ئۈستىدىكى قالدۇق تامچە) ، ئەمما ئوقنىڭ ئىچىدە Atto647N-Tau441 بولغان ThT مۇسبەت قۇرۇلمىلار ئىنتايىن ئاجىز ئىدى.بۇ ئىلگىرى تەسۋىرلەنگەن داغلارنىڭ چوڭ-كىچىكلىكى ، شەكلى ۋە ئورنىنى كۆپەيتىدۇ (5b رەسىم ، ئوتتۇرا ۋە ئاستى قۇر) ، بۇ داغلارنىڭ قېرىش سۇيۇقلۇقى كوكراتسىيىسىدە شەكىللەنگەن ئامىلوئىدقا ئوخشاش يىغىلىشلارغا ماس كېلىشى مۇمكىنلىكىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ.
WF 25 μM αS ھەر خىل يوشۇرۇن دەۋرى ۋە فوكۇس ئېگىزلىكى (z ، چەكسىز ئاستىدىن ئارىلىق) 25 μM Tau441 (1 μM AF488 ماركىلىق αS ۋە Atto647N ماركىلىق Tau441) نىڭ ئالدىدا LLPS بۇففېرلىق قۇدۇق بار) .مۇشۇنىڭغا ئوخشاش نەتىجىلەر بىلەن ئالتە تەجرىبە مۇستەقىل تەكرارلاندى.b CF مىكروسكوپلۇق 25 μM αS نىڭ 25 μM Tau441 (1 μM Atto647N بەلگىسى Tau441) ۋە 12.5 μM thioflavin-T (ThT) نىڭ ئالدىدا.ئېغىرلىقتىكى ئاقسىل تامچىلىرى ۋە ساقلانغان ئاقسىل ئوقلىرى ۋە داغلار ئايرىم-ئايرىم ھالدا ئۈستى ۋە ئوتتۇرا قۇرلاردا كۆرسىتىلدى.ئاستىنقى قۇردا 3 مۇستەقىل كۆپەيتىلگەن رەسىم ۋە تامچە رەسىملەر كۆرسىتىلدى.ئاق يا ئوق ھەر ئىككى تاختايدا ThT مۇسبەت چېكىتنى كۆرسىتىدۇ.بارلىق رەسىملەرنىڭ ئۆلچەم بالدىقى 20 µm.
سۇيۇقلۇقتىن قاتتىق ھالەتكە ئۆتۈش جەريانىدا كوكراتسىمان ئاقسىل تورىدىكى ئۆزگىرىشلەرنى تېخىمۇ تەپسىلىي تەكشۈرۈش ئۈچۈن ، بىز فتور فېرمېنسىيىلىك ئۆمۈرلۈك تەسۋىر ھاسىل قىلىش (FLIM) ۋە فورستېر رېزونانىس ئېنېرگىيىسى يۆتكىلىش مىكروسكوپى (FRET) نى ئىشلەتتۇق (6-رەسىم ۋە قوشۇمچە 8-ۋە 9-رەسىملەر).بىز شۇنى پەرەز قىلدۇقكى ، قەۋەتنىڭ قويۇقلىشىشى تېخىمۇ قويۇق ، ھەتتا قاتتىق ئوخشايدىغان يىغىلىپ قالغان ئاقسىل قۇرۇلمىسىغا ئايلىنىپ ، ئاقسىل بىلەن ئۇنىڭغا باغلانغان فلۇئورېسسېنسىيە تەكشۈرۈش ئەسۋابىنىڭ قويۇق ئالاقىسىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ ، بۇ بەلكىم ئۆمرىنىڭ قىسقىراپ كېتىشىدە ئىپادىلىنىدۇ. ، ئىلگىرى بايان قىلىنغاندەك 40., 41, 42.بۇنىڭدىن باشقا ، قوش بەلگە ئەۋرىشكىسى (AF488 ۋە Atto647N ئايرىم-ئايرىم ھالدا FRET ئىئانە قىلغۇچى ۋە قوبۇل قىلغۇچى بوياق سۈپىتىدە) ئۈچۈن ، τ نىڭ تۆۋەنلىشىگە LSPT دەۋرىدە قويۇق قويۇقلاشتۇرۇش ۋە FRET (E) ئۈنۈمىنى ئاشۇرۇش بىلەن بىللە بولىدۇ.بىز LLPS αS / Tau441 ۋە αS / ΔNt-Tau ئەۋرىشكىسىدە سال ۋە داغنىڭ شەكىللىنىشىنى نازارەت قىلدۇق (LLPS بۇففېردىكى ھەر بىر ئاقسىلنىڭ 25 µM تەركىبىدە αS ۋە / ياكى Tau441 ياكى ΔNt-Tau دەپ يېزىلغان Atto647N بار).بىز AF488 (τ488) ۋە Atto647N (τ647N) تەكشۈرۈش ئەسۋابىنىڭ فتور فېرمېنسىيىلىك ئۆمرىنىڭ كوكراتلارنىڭ پىشىپ يېتىلىشىگە ئەگىشىپ ئازراق تۆۋەنلىگەنلىكىدە ئومۇمىي يۈزلىنىشنى كۆردۇق (6-رەسىم ۋە قوشۇمچە 8c رەسىم).قىزىقارلىق يېرى ، بۇ ئۆزگىرىش ئوق ئىچىدىكى چېكىتلەر ئۈچۈن كۆرۈنەرلىك يۇقىرى كۆتۈرۈلگەن (6c رەسىم) ، بۇ چېكىتلەردە ئاقسىلنىڭ قويۇقلۇقىنىڭ تېخىمۇ كۆپ بولىدىغانلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ.بۇنى قوللاش ئۈچۈن ، 24 سائەتلىك αS / ΔNt-Tau تامچىلىرىدا فلۇئورېسسېنسىيە ئۆمرىدە كۆرۈنەرلىك ئۆزگىرىش كۆرۈلمىدى (قوشۇمچە 8d رەسىم) coacervates.دىققەت قىلىشقا تېگىشلىكى شۇكى ، چېكىتلەرنىڭ αS دىكى چوڭ-كىچىكلىكى ۋە ئۆزگىرىشچانلىقى ئوخشىمايدۇ ، بولۇپمۇ αS / Tau441 سىستېمىسى ئۈچۈن (قوشۇمچە 8-رەسىم).نەق مەيدان فلۇئورېسسېنسىيە ئۆمرىنىڭ تۆۋەنلىشى كۈچلۈكلۈكنىڭ ئېشىشىغا ئەگىشىپ كەلگەن ، بولۇپمۇ Tau441 ماركىسىدىكى Atto647N (قوشۇمچە 8a رەسىم) ، ھەمدە αS / Tau441 ۋە αS / ΔNt-Tau سىستېمىسىنىڭ ھەر ئىككىسىنىڭ FRET ئۈنۈمى تېخىمۇ يۇقىرى بولۇپ ، LLPS بەش سائەتتە تېخىمۇ قويۇقلاشقانلىقىنى كۆرسىتىدۇ. قوزغالغاندىن كېيىن ، تۇراقلىق توك ئىچىدىكى ئاقسىل قويۇقلاشقان.SS / ΔNt-Tau غا سېلىشتۇرغاندا ، بىز تۆۋەن τ647N ۋە αS / Tau441 نۇقتىلىرىدا بىر ئاز يۇقىرى τ488 قىممەتنى كۆردۇق ، تۆۋەن ۋە تېخىمۇ كۆپ ئوخشاش بولمىغان FRET قىممىتى بار.مۇمكىن ، بۇ بەلكىم αS / Tau441 سىستېمىسىدا ، كۈزەتكەن ۋە مۆلچەرلەنگەن αS توپلىمىنىڭ كۆپلۈكى تاۋغا سېلىشتۇرغاندا كۆپ خىل بولۇپ ، Tau441 نىڭ ئۆزىمۇ LLPS ۋە توپلىنىشنى باشتىن كەچۈرۈشى مۇمكىن (قوشۇمچە 8-رەسىم) .قانداقلا بولمىسۇن ، Tau441 ۋە αS ھەر ئىككىسى بولغاندا ، تامچە ئۇيۇشۇش دەرىجىسى ، ئوقنىڭ شەكىللىنىشى ۋە ئەڭ مۇھىمى سۇيۇقلۇققا ئوخشاش كوكراتات ئىچىدىكى ئاقسىلنىڭ توپلىنىشى ئەڭ يۇقىرى بولىدۇ.
LLPS بۇففېردىكى ھەر بىر ئاقسىلنىڭ 25 μMM دىكى αS / Tau441 ۋە αS / ΔNt-Tau نىڭ ئۆمۈرلۈك فلۇئورېسسېنسىيە مىكروسكوپى (FLIM) رەسىملىرى.بۇ ئىستونلاردا ئوخشىمىغان يېتىلىش مەزگىلىدە (30 مىنۇت ، 5 سائەت ۋە 24 سائەت) LLPS ئەۋرىشكىسىنىڭ ۋەكىللىك رەسىملىرى كۆرسىتىلدى.قىزىل رامكىدا αS / Tau441 داغ بار رايون كۆرسىتىلدى.ئۆمرى رەڭلىك بالداق سۈپىتىدە كۆرسىتىلىدۇ.بارلىق رەسىملەر ئۈچۈن كىچىك بالداق = 20 µm.b تاللانغان رايوننىڭ چوڭايتىلغان FLIM رەسىمى ، a گۇرۇپپىدىكى قىزىل قۇتىدا كۆرسىتىلدى.ھاياتلىق دائىرىسى A گۇرۇپپىدىكىگە ئوخشاش رەڭ ئۆلچىمى ئارقىلىق كۆرسىتىلىدۇ.كىچىك بالداق = 5 µm.س αS / ΔNt-Tau coacervate ئەۋرىشكىسى (D ئۈچۈن N = 17-32 ROI ، R ئۈچۈن 29-44 ROI ، نومۇر ئۈچۈن 21-51 ROI).ئوتتۇراھال ۋە ئوتتۇراھال قىممەتلەر ئايرىم-ئايرىم ھالدا ساندۇقنىڭ ئىچىدە سېرىق چاسا ۋە قارا سىزىق سۈپىتىدە كۆرسىتىلىدۇ.رامكىنىڭ تۆۋەن ۋە ئۈستى تەرىپى ئايرىم-ئايرىم ھالدا بىرىنچى ۋە ئۈچىنچى پەسىلگە ۋەكىللىك قىلىدۇ ، 1.5 ھەسسىلىك ئارىلىق ئارىلىقى (IQR) ئىچىدىكى ئەڭ تۆۋەن ۋە ئەڭ چوڭ قىممىتى ۋىۋىسكا شەكلىدە كۆرسىتىلىدۇ.سىرتقا چىققۇچىلار قارا ئالماس سۈپىتىدە كۆرسىتىلدى.جۈپ تەقسىماتنىڭ ستاتىستىكىلىق ئەھمىيىتى ئوخشاش بولمىغان ئوخشىماسلىقنى كۆزدە تۇتۇپ ، ئىككى ئەۋرىشكەلىك T سىناقتىن پايدىلىنىپ بېكىتىلدى.ئىككى قۇيرۇقلۇق T سىناق p قىممىتى ھەر بىر جۈپ سانلىق مەلۇماتنىڭ يۇلتۇز بەلگىسى بىلەن كۆرسىتىلىدۇ (* p- قىممەت> 0.01 ، ** p قىممىتى> 0.001 ، *** p- قىممىتى> 0.0001 ، **** p-value> 0.00001), ns سەل قاراشنى كۆرسىتىدۇ (p-value> 0.05).ئېنىق p قىممىتى 1-جەدۋەلدە بېرىلگەن ، ئەسلى سانلىق مەلۇمات خام ماتېرىيال ھۆججىتى سۈپىتىدە كۆرسىتىلدى.
دانىخورەك ياكى يىغىلغان ماددىلارنىڭ ئامىلوئىدقا ئوخشاش خاراكتېرىنى تېخىمۇ نامايان قىلىش ئۈچۈن ، بىز قويۇقلۇقى يۇقىرى بولغان (1 M) NaCl بىلەن 24 سائەت داغلانمىغان كوكراتسىمان ئەۋرىشكىنى داۋالىدۇق ، نەتىجىدە يىغىلغان ماددىلار ئاقسىلنىڭ قويۇقلۇقىدىن ئايرىلدى.ئاتوم ئېنېرگىيىسى مىكروسكوپ (AFM) ئارقىلىق يەككە يىغىلىش (يەنى يىغىلغان ماددىلارنىڭ تارقاق ئېرىتمىسى) كۆزەتكەندە ، بىز ئادەتتە ئېگىزلىكى تەخمىنەن 15 nm بولغان شارسىمان مورفولوگىيەنى كۆزەتتۇق ، بۇ تۇز قويۇقلۇقى يۇقىرى شارائىتتا ئۆز-ئارا باغلىنىشقا مايىل. يەر يۈزىدىكى كۈچلۈك گىدروپوبىك تەسىرىدىن تىپىك ئامىلوئىد تالاسىنىڭ ھەرىكىتى (تالانىڭ ئادەتتە ئېگىزلىكى ~ 10 nm غا دىققەت قىلىڭ) (قوشۇمچە 10a رەسىم).قىزىقارلىق يېرى ، ئۆلچەملىك ThT فلۇئورېسسېنسىيە تەكشۈرۈشىدە يەككە يىغىلغان ماددىلار ThT بىلەن سىڭدۈرۈلگەندە ، بىز ThT فلۇئورېسسېنسىيە كۋانت مەھسۇلات مىقدارىنىڭ شىددەت بىلەن ئاشقانلىقىنى كۆردۇق ، بۇ بوياق تىپىك αS ئامىلوئىد تالاسى بىلەن بويالغان ۋاقىتتا كۆرۈلگەنگە سېلىشتۇرغاندا (10b قوشۇمچە رەسىم). كوكراتات توپلىمىدا ئامىلوئىدقا ئوخشاش قۇرۇلمىلار بار..ئەمەلىيەتتە ، يىغىلغان ماددىلار يۇقىرى تۇز قويۇقلۇقىغا بەرداشلىق بېرەلەيتتى ، ئەمما تىپىك ئامىلوئىد تالاغا ئوخشاش 4 M گانىدىن خىلور (GdnHCl) غا سەزگۈر ئىدى (قوشۇمچە 10c رەسىم).
كېيىنكى قەدەمدە ، بىز يەككە مولېكۇلا فلۇئورېسسېنسىيىسى ، كونكېرت فلۇئورېسسېنسىيە باغلىنىشى / ئۆز-ئارا مۇناسىۋەتلىك سپېكتروسكوپ (FCS / FCCS) ئارقىلىق يىغىندىلارنىڭ تەركىبىنى تەھلىل قىلىپ ، ئىككى خىل رەڭلىك تاسادىپىيلىقنى بايقاش (TCCD) نى پارتىلاتتۇق.بۇنىڭ ئۈچۈن ، بىز αS ۋە Tau441 (ھەر ئىككىسى 25 mMM) بولغان 100 مىللىمېتىرلىق LLPS ئەۋرىشكىسىدە 24 سائەت يوشۇرۇنغاندىن كېيىن شەكىللەنگەن توپلاملارنى ئايرىدۇق ، 1 μM AF488 ماركىلىق αS ۋە 1 μM Atto647N ماركىلىق Tau441.ھاسىل بولغان تارقاقلاشتۇرۇلغان ئومۇمىي ھەل قىلىش چارىسىنى ئوخشاش PEG يوق بۇففېر ۋە 1 M NaCl (ئوخشاش بىرىكمە زاپچاسنى ماسلاشتۇرغۇچتىن ئايرىپ ئىشلىتىشكە ئىشلىتىلىدۇ) ئىشلىتىپ يەككە يەككە ھالەتكە سۇيۇلدۇرۇپ ، LLPS بىلەن ئاقسىل ئوتتۇرىسىدىكى ئېلېكتر سىستىما ئۆز-ئارا تەسىرنىڭ ئالدىنى ئالىدۇ.7a رەسىمدە يەككە مولېكۇلانىڭ ۋاقىت مۇساپىسىنىڭ مىسالىنى كۆرگىلى بولىدۇ.FCCS / FCS تەھلىلى (ئۆز-ئارا باغلىنىشلىق ، CC ۋە ئۆز-ئارا باغلىنىشلىق ، AC) ئەۋرىشكىلەردە αS ۋە تاۋنى ئۆز ئىچىگە ئالغان يىغىلغان ماددىلارنىڭ مول ئىكەنلىكىنى كۆرسەتتى (7b رەسىمدىكى CC ئەگرى سىزىقىغا قاراڭ ، سول تەرەپتىكى) ، قالدۇق مونومېرلىق ئاقسىلنىڭ ئېشىپ كېتىشى a سۈپىتىدە پەيدا بولدى. سۇيۇلۇش جەريانىنىڭ نەتىجىسى (7b رەسىمدىكى سول ئەگرى سىزىقتىكى AC ئەگرى سىزىققا قاراڭ).ئوخشاش مونوپوللۇق ئاقسىلنى ئۆز ئىچىگە ئالغان ئەۋرىشكە ئارقىلىق ئوخشاش ھەل قىلىش شارائىتىدا ئېلىپ بېرىلغان كونترول تەجرىبىسىدە CC ئەگرى سىزىقى يوقلىقى كۆرسىتىلدى ، AC ئەگرى سىزىقى بىر تەركىبلىك تارقىلىش ئەندىزىسىگە ماس كېلىدۇ (4-رەسىم) ، بۇ يەردە مونومېرلىق ئاقسىلنىڭ مۆلچەردىكى تارقىلىش كوئېففىتسېنتى بار (7b رەسىم). ), right panel).يىغىلغان زەررىچىلەرنىڭ تارقىلىش كوئېففىتسېنتى 1 µm2 / s دىن تۆۋەن ، مونومېرلىق ئاقسىلنىڭ مىقدارى تەخمىنەن 1 µm2 / s.50–100 µm / s;قىممەتلەر ئوخشىشىپ كېتىدىغان ھەل قىلىش شارائىتىدا sonic αS ئامىلوئىد تالاسى ۋە مونومېرلىق αS ئۈچۈن ئىلگىرى ئېلان قىلىنغان قىممەتلەرگە ئوخشايدۇ.بىز TCCD پارتلاش ئانالىزى (7c رەسىم ، ئۈستۈنكى تاختاي) ئارقىلىق توپلانغان ماددىلارنى تەھلىل قىلغىنىمىزدا ، ھەر بىر يەككە يىغىلغان توپنىڭ (αS / Tau heteroaggregate) بايقىلىشىچە ، بايقالغان توپلاملارنىڭ تەخمىنەن% 60 ى αS ۋە tau نى ئۆز ئىچىگە ئالغان بولۇپ ، تەخمىنەن% 30 ئىچىدە پەقەت% 30 بار. tau ، تەخمىنەن% 10 αS.Stoichiometric αS / Tau heteroaggregates نىڭ ئانالىز نەتىجىسىدە كۆرسىتىلىشىچە ، كۆپ قىسىم گېئوگرافىكلار تاۋدا موللاشتۇرۇلغان (stoichiometry 0.5 دىن تۆۋەن ، ھەر بىر تاك مولېكۇلىنىڭ ئوتتۇرىچە سانى αS مولېكۇلاسىدىن 4 ھەسسە كۆپ) ، بۇ بىزنىڭ FLIM دا كۆزىتىلگەن خىزمىتىمىز بىلەن بىردەك. تەجرىبە..FRET تەھلىلىدە كۆرسىتىلىشچە ، بۇ بىرىكمىلەردە ھەر ئىككى خىل ئاقسىل بار بولۇپ ، گەرچە بۇ ئەھۋالدا ئەمەلىي FRET قىممىتى ئانچە مۇھىم بولمىسىمۇ ، ئەمما تەجرىبىدە ئىشلىتىلگەن ئاقسىلنىڭ ئېشىپ كېتىشى سەۋەبىدىن ھەر بىر توپلامدا فتوروفورنىڭ تارقىلىشى تاسادىپىي بولغان.قىزىقارلىق يېرى ، بىز 45،46 پىشقان ئامىلوئىد توپلاش كەمتۈك Tau ۋارىيانتىنى ئىشلىتىپ ئوخشاش تەھلىلنى قىلغىنىمىزدا (قوشۇمچە 11-رەسىم ، b گە قاراڭ) ، بىز گەرچە αS ئېلېكتروستاتتىك يىغىلىشنىڭ ئوخشاش ئىكەنلىكىنى بايقىدۇق (قوشۇمچە 11c ، d) ، كوئوردېناتنىڭ ئىچىدە يىغىلىش ھاسىل قىلىش ئىقتىدارى زور دەرىجىدە تۆۋەنلەپ ، FLIM نەق مەيدان تەجرىبىسىدە بىر قانچە ئورۇننى بايقىدى ، يەككە يىغىلغان ئەۋرىشكە ئۈچۈن ئاجىز ئۆز-ئارا باغلىنىش ئەگرى سىزىقى بايقالدى.قانداقلا بولمىسۇن ، بايقالغان ئاز ساندىكى توپلاملارغا نىسبەتەن (Tau441 نىڭ پەقەت ئوندىن بىرى) ، بىز ھەر بىر توپنىڭ بۇ تاۋ ۋارىيانتىغا قارىغاندا αS دا بېيىغانلىقىنى بايقىدۇق ، بايقالغان توپلاملارنىڭ تەخمىنەن% 50 ىدە پەقەت αS مولېكۇلا بار ، αS بولسا كۆپ خىل بولىدۇ. .يىغىلغان توپلار (قوشۇمچە 11-رەسىمگە قاراڭ) ، Tau441 ھاسىل قىلغان ئوخشىمىغان گۇرۇپپىلارغا سېلىشتۇرغاندا (6-رەسىم).بۇ تەجرىبىلەرنىڭ نەتىجىسى شۇنى ئىسپاتلىدىكى ، گەرچە αS نىڭ ئۆزى تاكتىكا ئىچىدە تاۋ بىلەن يىغىلىش ئىقتىدارىغا ئىگە بولسىمۇ ، ئەمما بۇ شارائىتتا تاۋ يادروسى تېخىمۇ پايدىلىق ، نەتىجىدە ھاسىل بولغان ئامىلوئىدقا ئوخشاش يىغىلغان ماددىلار αS ۋە تاۋنىڭ رولىنى ئوينايدۇ.قانداقلا بولمىسۇن ، تاۋ مول يادرو شەكىللەنگەندىن كېيىن ، αS بىلەن تاۋ ئوتتۇرىسىدىكى گېروپروتىك ئۆز-ئارا تەسىرلەر توپ مولېكۇلا ئارىسىدىكى ئۆز-ئارا تەسىر سەۋەبىدىن توپلىنىدۇ.بىز يەنە سۇيۇق αS / tau coacervates دىكى ئاقسىل تورىنى كۆزىتىمىز.
αS / Tau441 ئېلېكتر سىتاتىك كوكراتسىيىسىدە شەكىللەنگەن يەككە يىغىلغان يەككە مولېكۇلانىڭ ۋەكىللىك فلۇئورېسسېنسىيە ۋاقىتلىق ئىزلىرى.ئۈچ بايقاش قانىلىدا (بىۋاسىتە ھاياجانلانغاندىن كېيىن ، كۆك ۋە قىزىل سىزىقلار ، ۋاسىتىلىك ھاياجانلانغاندىن كېيىن Atto647N قويۇپ بېرىش) ، FRET ، بىنەپشە سىزىق) αS / Tau441 قېتىشمىسىغا ماس كېلىدىغان پارتىلاش (كۆرسىتىلگەن چەكتىن يۇقىرى يېرىلىش) كۆرۈلگەن.b FCS / FCCS LLPS (سول تەرەپ تاختىسى) دىن ئېرىشكەن يەككە αS / Tau441 توپلىمىنىڭ ئەۋرىشكىسىنى ئانالىز قىلدى.AF488 ۋە Atto647N نىڭ ئاپتوماتىك باغلىنىش (AC) ئەگرى سىزىقى ئايرىم-ئايرىم ھالدا كۆك ۋە قىزىل رەڭدە ، ھەر ئىككى بوياقنى ئۆز ئىچىگە ئالغان يىغىلىش بىلەن مۇناسىۋەتلىك ئۆز-ئارا مۇناسىۋەتلىك (CC) ئەگرى سىزىق بىنەپشە رەڭدە كۆرسىتىلدى.AC ئەگرى سىزىقلىق مونومېرلىق ۋە يىغىلغان ئاقسىل تۈرىنىڭ مەۋجۇتلۇقىنى ئەكس ئەتتۈرىدۇ ، CC ئەگرى سىزىقى پەقەت قوش بەلگە توپلانغان ماددىلارنىڭ تارقىلىشىنىلا كۆرسىتىدۇ.ئوخشاش ئانالىز ، ئەمما يەككە نۇقتىلارغا ئوخشاش ھەل قىلىش شارائىتىدا ، پەقەت مونومېرلىق αS ۋە Tau441 بولغان ئەۋرىشكەلەر ئوڭ تەرەپتىكى كونترول سۈپىتىدە كۆرسىتىلىدۇ.c αS / Tau441 ئېلېكتر سىتاتىك كوكراتسىيىسىدە شەكىللەنگەن يەككە يىغىلغان يەككە مولېكۇلانىڭ فلۇئورېسسېنسىيە چاقماق ئانالىزى.تۆت خىل تەكرارلاش (N = 152) دىن تېپىلغان ھەر بىر توپلامنىڭ ئۇچۇرلىرى ئۇلارنىڭ ستوئىئومىتىرىيىسى ، S قىممىتى ۋە FRET ئۈنۈمى (پىلان تاختىسى ، رەڭ بالدىقى ھادىسىنى ئەكس ئەتتۈرىدۇ) غا قارشى پىلانلانغان.ئۈچ خىل توپلامنى پەرقلەندۈرۈشكە بولىدۇ: -αS پەقەت S ~ 1 ۋە FRET ~ 0 بولغان توپلاملار ، پەقەت S ~ 0 ۋە FRET ~ 1 بولغان Tau توپلىمىسى ، ئارىلىقتىكى S ۋە FRET نىڭ ئوتتۇرىچە مۆلچەرى بولغان ئوخشىمىغان Tau / αS توپلىمى. ھەر بىر گېن توپلىمىدا بايقالغان ھەر ئىككى بەلگە ئاقسىلى (N = 100) تۆۋەنكى تاختايدا كۆرسىتىلدى (رەڭ ئۆلچىمى يۈز بەرگەنلىكىنى ئەكس ئەتتۈرىدۇ).خام سانلىق مەلۇمات خام ماتېرىيال ھۆججىتى شەكلىدە تەمىنلەنگەن.
سۇيۇق ئاقسىلنىڭ يېتىلىشى ياكى قېرىشى ۋاقىتنىڭ ئۆتۈشىگە ئەگىشىپ گېلىغا ئوخشاش ياكى قاتتىق قۇرۇلمىلارغا ئايلىنىدۇ ، دوكلاتتا ئاممىلوئىد يىغىلىشنىڭ ئالدىدىكى بىنورمال جەريان سۈپىتىدە ، كوندېنساتنىڭ 47 ۋە شۇنداقلا كېسەللىكنىڭ بىر قانچە فىزىئولوگىيىلىك ئىقتىدارىغا قاتناشقانلىقى خەۋەر قىلىنغان. باسقۇچنى ئايرىش ۋە ھەرىكەتنى تەپسىلىي ئۆگىنىمىز.LSPT αS تۆۋەن مىكرومولار قويۇقلۇقى ۋە فىزىئولوگىيىلىك مۇناسىۋەتلىك شارائىتتا كونترول قىلىنىدىغان مۇھىتتا تاسادىپىي كۆپ قۇتۇپلىشىش ئالدىدا (دىققەت قىلىڭ ، αS نىڭ ھېسابلانغان فىزىئولوگىيىلىك قويۇقلۇقى> 1 µM50) ، LPS نىڭ تىپىك ئىسسىقلىق بىلەن ھەرىكەتلىنىشىدىن كېيىن.بىز فىزىئولوگىيىلىك pH دىكى سەلبىي زەرەتلەنگەن C تېرمىنال رايونىنى ئۆز ئىچىگە ئالغان αS نىڭ ئېلېكتر سىستىما جەريانىدا LLK ئارقىلىق ئاقسىل ئېرىتمىسىدە LLPS ئارقىلىق ئاقسىل مول تامچە ھاسىل قىلالايدىغانلىقىنى بايقىدۇق. توپلاشتۇرۇلغان ماكرو مولېكۇلا ئالدىدا مۇرەككەپ قويۇقلىشىش.بۇ جەريان بەلكىم ھۈجەيرە مۇھىتىدا مۇناسىۋەتلىك تەسىرلەرگە ئىگە بولۇشى مۇمكىن ، αS ۋىرۇس ۋە vivo دىكى كېسەللىككە مۇناسىۋەتلىك يىغىلىش بىلەن مۇناسىۋەتلىك ھەر خىل كۆپ قۇتۇپلۇق مولېكۇلاغا يولۇقۇشى مۇمكىن.
نۇرغۇن تەتقىقاتلاردا ، تامچە ئىچىدىكى ئاقسىلنىڭ ھەرىكەتچانلىقى يېتىلىش جەريانىنى بەلگىلەيدىغان مۇھىم ئامىللارنىڭ بىرى دەپ قارالدى.ئېلېكتىروستاتىك αS كۆپ قۇتۇپلىشىش بىلەن ماسلىشىدۇ ، يېتىلىش جەريانى ئېنىقكى كۆپ قۇتۇپلىشىش بىلەن ئۆز-ئارا تەسىرنىڭ كۈچلۈكلۈكىگە ، ۋالېنتىغا ۋە بۇ ئۆز-ئارا تەسىرنىڭ كۆپلۈكىگە باغلىق.تەڭپۇڭلۇق نەزەرىيىسى شۇنى كۆرسىتىپ بېرىدۇكى ، ئىككى سۇيۇقلۇق ھالەتتىكى تەڭپۇڭلۇق مەنزىرىسى LLPS57,58 نى قوزغىتىدىغان بىئوپولىمېر مول بولغان چوڭ تامچىنىڭ مەۋجۇتلۇقى بولىدۇ.تامچە ئۆسۈشنى Ostwald نىڭ يېتىلىشى 59 ، بىرىكمە 60 ياكى تارقاق باسقۇچتا ھەقسىز مونومون ئىستېمال قىلىش ئارقىلىق ئەمەلگە ئاشۇرغىلى بولىدۇ.SS ۋە Tau441 ، ΔNt-Tau ياكى pLK غا نىسبەتەن ، ئاقسىلنىڭ كۆپىنچىسى بۇ تەتقىقاتتا ئىشلىتىلگەن شارائىتتا قويۇق قويۇقلۇققا مەركەزلەشكەن.قانداقلا بولمىسۇن ، چوڭ رازمېرلىق تاۋ تامچىلىرى يەر يۈزىدىكى ھۆللۈكتە تېزلىكتە بىرىكىپ كەتكەن بولسىمۇ ، ΔNt-Tau ۋە pLK ئۈچۈن تامچە بىرىكىش ۋە ھۆللۈك تەسكە توختايدۇ ، بۇ بۇ ئىككى سىستېمىدا سۇيۇقلۇق خۇسۇسىيىتىنىڭ تېز يوقىلىدىغانلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ.بىزنىڭ FLIM-FRET تەھلىلىمىزگە قارىغاندا ، ياشانغان pLK ۋە ΔNt-Tau تامچىلىرى ئەسلىدىكى تامچە بىلەن ئوخشاش دەرىجىدىكى ئاقسىلنىڭ يىغىلىشى (ئوخشاش فلۇئورېسسېنسىيە ئۆمرى) نى كۆرسىتىپ ، ئەسلىدىكى ئاقسىل تورىنىڭ تېخىمۇ قاتتىق بولسىمۇ ساقلانغانلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ.
بىز تەجرىبە نەتىجىمىزنى تۆۋەندىكى مودېلدا مۇۋاپىقلاشتۇرىمىز (8-رەسىم).دەسلەپتە ۋاقىتلىق شەكىللەنگەن تامچە ئېلېكتر سىستىمىسى تولۇقلىمىسى بولمىغان ئاقسىل تورى بولۇپ ، شۇڭا توك تەڭپۇڭسىزلىقى بار رايونلار بار ، بولۇپمۇ تامچە كۆرۈنمە يۈزىدە ، ئېلېكتر سىستىما يۈزى يوشۇرۇن كۈچى يۇقىرى تامچىلار كېلىپ چىقىدۇ.توك تولۇقلاش (ئادەتتە ۋالېننىڭ خورىشى دەپ ئاتىلىدىغان ھادىسە) ۋە تامچىلىرىنىڭ يەر يۈزى يوشۇرۇن كۈچىنى ئەڭ تۆۋەن چەككە چۈشۈرۈش ئۈچۈن ، تامچە سۇيۇقلۇق باسقۇچىدىكى يېڭى پولى پېپتىدلارنى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ ، ئاقسىل تورىنى قايتا تەشكىللەپ ، زەرەتلەش ئۆز-ئارا تەسىرنى ئەلالاشتۇرىدۇ ۋە باشقا تامچىلار بىلەن ئۆز-ئارا تەسىر كۆرسىتىدۇ.يۈزى بىلەن (ھۆللۈك).SS / pLK تامچىلىرى ، ئاددىيراق ئاقسىل تورى (پەقەت αS بىلەن pLK ئارىسىدىكى گېروپوتىك ئۆز-ئارا تەسىر) ۋە ئاقسىل بىلەن ئاقسىلنىڭ ئۆز-ئارا تەسىرگە بولغان يېقىنلىقى سەۋەبىدىن ، قويۇق ماددىنىڭ زەربىسىنى تېخىمۇ تېز تەڭپۇڭلاشتۇرالايدىغاندەك قىلىدۇ.دەرۋەقە ، بىز دەسلەپتە شەكىللەنگەن αS / pLK كوئوردېناتتا αS / Tau غا قارىغاندا تېخىمۇ تېز ئاقسىل ھەرىكەتلىرىنى كۆردۇق.ۋالېنس خوراپ كەتكەندىن كېيىن ، ئۆز-ئارا تەسىر كۈچى تۆۋەنلەيدۇ ۋە تامچىلار سۇيۇقلۇق خۇسۇسىيىتىنى يوقىتىپ ، ئېلېكتر سىستىما يۈزى تۆۋەن (شۇڭا يەر يۈزىنى ھۆل قىلالمايدۇ) گېلىغا ئوخشاش ، ئاسان يانىدىغان تامچىلارغا ئايلىنىدۇ.سېلىشتۇرۇپ كەلسەك ، αS / Tau تامچىلىرى تېخىمۇ مۇرەككەپ ئاقسىل تورى (ھەم ئوخشاش ھەم ئوخشاش بولمىغان ئۆز-ئارا تەسىر كۆرسىتىدۇ) ۋە ئاقسىلنىڭ ئۆز-ئارا تەسىر قىلىشىنىڭ ئاجىزلىقى سەۋەبىدىن تامچە زەرەت تەڭپۇڭلۇقىنى ئەلالاشتۇرۇشتا ئۈنۈمى تۆۋەن بولىدۇ.بۇ ئۇزۇن مۇددەت سۇيۇقلۇق ھەرىكىتىنى ساقلاپ قالىدىغان ۋە يۇقىرى ئېلېكتىرو سىتاتىك يەر يۈزى يوشۇرۇن كۈچىنى نامايان قىلىپ ، ئۇيۇشۇش ۋە ئۆسۈپ يېتىلىش ئارقىلىق ئەڭ تۆۋەن چەككە چۈشۈپ قالىدۇ (بۇنىڭ بىلەن تامچىلىرىنىڭ يەر يۈزى / ھەجىم نىسبىتىنى تۆۋەنلىتىدۇ) ۋە گىدروفىللىق يەر يۈزىدىكى خىمىيىلىك ماددىلارنى ھۆل قىلىۋېتىدۇ.بۇ ئاقسىل تورىدا توكنى ئەلالاشتۇرۇشنى ئىزچىل ئىزدەش سەۋەبىدىن ئۆز-ئارا تەسىر ئىنتايىن ۋاقىتلىق بولغاچقا ، سۇيۇقلۇق خۇسۇسىيىتىنى ساقلاپ قالىدىغان چوڭ قويۇق ئاقسىل كۈتۈپخانىلىرىنى بارلىققا كەلتۈرىدۇ.قىزىقارلىق يېرى ، تاۋنىڭ N تېرمىنالىدا قىسقارتىلغان شەكىللىرى ، جۈملىدىن بىر قىسىم تەبىئىي پەيدا بولغان ئىزفورم 62 نى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ ، ئارىلىق ھەرىكىتىنى نامايەن قىلىدۇ ، بەزى كوكراتلار αS بىلەن قېرىشنى ئۇزۇن ئۆمۈر كۆرىدىغان گېلى تامچىلىرىغا ئايلاندۇرىدۇ ، يەنە بەزىلىرى چوڭ سۇيۇقلۇق قويۇق ھالەتكە كېلىدۇ.SS ئېلېكتىروستاتىك كوئوردېناتنىڭ يېتىلىشىدىكى بۇ ئىككى خىللىق يېقىنقى LLPS نەزەرىيىۋى ۋە تەجرىبە تەتقىقاتى بىلەن بىردەك بولۇپ ، قويۇق ماددىلارنىڭ ۋالېننىڭ خورىشى بىلەن ئېلېكتر سىتاتىك ئېرىتىش ئوتتۇرىسىدىكى باغلىنىشنى كوندېنساتنىڭ چوڭ-كىچىكلىكى ۋە سۇيۇقلۇق خۇسۇسىيىتىنى كونترول قىلىشنىڭ ئاچقۇچى قىلىپ بېكىتتى.مېخانىزم 58.61.
بۇ لايىھە LLPS ۋە LSPT ئارقىلىق αS ۋە Tau441 نىڭ قويۇق ئامىلوئىد توپلاش يولىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ.قوشۇمچە ئانون مول (قىزىل) ۋە كاتېگورىيە مول (كۆك) رايونلار بىلەن ، αS ۋە تاۋ ئېلېكتىروستاتىك كوئوردېناتنىڭ قانائەتلىنەرلىك قىممىتى بار يەر يۈزى ئېنېرگىيىسى تۆۋەنرەك بولىدۇ ، شۇڭا ئۇيۇشۇش كۈچى تۆۋەنلەپ ، تامچە قېرىشنى تېزلىتىدۇ.تۇراقلىق بولمىغان گېلى ھالىتى ئەمەلگە ئاشىدۇ..بۇ خىل ئەھۋال αS / pLK سىستېمىسىغا نىسبەتەن ئىنتايىن پايدىلىق ، چۈنكى ئۇنىڭ يېقىنلىقى تېخىمۇ يۇقىرى ، ئاقسىل-جۈپ ئۆز-ئارا تەسىر تورى تېخىمۇ ئاددىي بولۇپ ، گېلىغا ئوخشاش تېز ئۆتۈشكە شارائىت ھازىرلايدۇ.ئەكسىچە ، قانائەتلىنەرلىك قىممەتكە ئىگە تامچىلار ، شۇڭلاشقا ، ئاقسىل قاچىلانغان رايونلار ئۆز-ئارا تەسىر كۆرسىتەلەيدۇ ، يەر يۈزىنىڭ يۇقىرى ئېنېرگىيىسىنى تۆۋەنلىتىش ئۈچۈن ، سۇيۇقلۇقنىڭ يۈزىنى بىرىكتۈرۈپ ۋە ھۆل قىلىۋېتىدۇ.بۇ خىل ئەھۋال ئاجىز Tau-Tau ۋە αS-Tau ئۆز-ئارا تەسىردىن تەركىب تاپقان كۆپ خىل مۇرەككەپ تورغا ئىگە αS / Tau441 ماسلاشتۇرغۇچقا ماس كېلىدۇ.ئۆز نۆۋىتىدە ، چوڭراق كوكراتلار سۇيۇقلۇققا ئوخشاش خۇسۇسىيەتنى تېخىمۇ ئاسان ساقلاپ ، باشقا ئاقسىل بىلەن ئاقسىلنىڭ ئۆز-ئارا تەسىر كۆرسىتىشىگە يول قويىدۇ.ئاخىرىدا ، كوئوردېنات سۇيۇقلۇقىنىڭ ئىچىدە αS ۋە تاۋ شەكلىنى ئۆز ئىچىگە ئالغان ئامىلوئىد گېروگېنلىق بىرىكمىلەر ، بۇ بەلكىم نېرۋا ئاجىزلاش كېسەللىكلىرىنىڭ ئالاھىدىلىكى بولغان ئۆز ئىچىگە ئالغان جەسەتلەر بىلەن مۇناسىۋەتلىك بولۇشى مۇمكىن.
چوڭ سۇيۇقلۇققا ئوخشاش قۇرۇلمىلار αS / Tau441 نىڭ پىشىپ يېتىلىشىدە شەكىللەنگەن ، ئەمما قويۇقلۇقى يۇقىرى ، ئەمما ھەرىكەتچان ئاقسىل مۇھىتى ۋە مەلۇم مەنىدىن ئېيتقاندا ، αS / ΔNt-Tau كوكراتسىيىسى ئاقسىلنىڭ يىغىلىشىدىكى كۆڭۈلدىكىدەك سۇ ئامبىرى.بىز بۇ خىل ئاقسىل كوئوردېناتلىرىدا قاتتىق ئاقسىل بىرىكمىسىنىڭ شەكىللەنگەنلىكىنى كۆردۇق ، كۆپىنچە αS ۋە تاۋنى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ.بىز بۇ خىل گېروگرافىكلارنىڭ ئېلېكتر سىتاتىك بولمىغان ئۆز-ئارا تەسىر ئارقىلىق مۇقىملاشقانلىقىنى ، تىپىك ئامىلوئىد تالاسىغا ئوخشاش ئامىلوئىدقا خاس ThT بوياقلىرىنى باغلىيالايدىغانلىقىنى ، ھەقىقەتەنمۇ ھەر خىل تەسىرلەرگە قارشى تۇرۇش كۈچىنىڭ بارلىقىنى كۆرسىتىپ ئۆتتۇق.LLPS تەرىپىدىن شەكىللەنگەن αS / tau بىرىكمىسىنىڭ ئامىلوئىدقا ئوخشاش خۇسۇسىيىتى بارلىقى كۆرسىتىلدى.دەرۋەقە ، تاۋنىڭ ئامىلوئىد يىغىلىشىدىكى پىشىپ يېتىلگەن ۋارىيانتى سۇيۇق ئېلېكتروستاتتىك كوكراتنىڭ ئىچىدە بۇ خىل ئوخشىمىغان αS توپلىمىنىڭ شەكىللىنىشىدە كۆرۈنەرلىك توسالغۇغا ئۇچرايدۇ.SS / Tau441 يىغىلغان ماددىلارنىڭ شەكىللىنىشى پەقەت سۇيۇقلۇققا ئوخشاش خۇسۇسىيەتنى ساقلاپ قالغان كوكۇس قاپارتمىسىدىلا كۆرۈلگەن ، ئەگەر كوكۇس / تامچە گېلى ھالىتىگە يەتمىسە ، ھەرگىز بولمايدۇ.كېيىنكى ئەھۋال ئاستىدا ، ئېلېكتر سىتاتىك ئۆز-ئارا تەسىرنىڭ كۈچىيىشى ۋە نەتىجىدە ، ئاقسىل تورىنىڭ قاتتىقلىقى ئاقسىلنىڭ زۆرۈر ماسلىشىشچان تەڭشىلىشىنىڭ ئالدىنى ئېلىپ ، ئامىلوئىد يادروسىغا ئېھتىياجلىق يېڭى ئاقسىل ئۆز-ئارا تەسىر پەيدا قىلىدۇ.قانداقلا بولمىسۇن ، تېخىمۇ جانلىق ، سۇيۇقلۇققا ئوخشاش كوكراتتا ئېرىشكىلى بولىدۇ ، چوڭ-كىچىكلىكى بىلەن ئۆز نۆۋىتىدە سۇيۇقلۇقنى ساقلاپ قېلىش ئېھتىماللىقى يۇقىرى.
قويۇقلىشىش باسقۇچىدا يىغىلىشنىڭ شەكىللىنىشى چوڭ αS / Tau قويۇقلۇقىدا تېز سۈرئەتتە كېلىدىغان كىچىك تامچىلارغا قارىغاندا ئەۋزەللىكى ، تامچە ئۇيۇشۇشنى كونترول قىلىدىغان ئامىللارنى بايقاشنىڭ باغلىنىشچانلىقىنى گەۋدىلەندۈرىدۇ.شۇڭا ، باسقۇچنى ئايرىش خاھىشى بولۇپلا قالماي ، كوندېنساتنىڭ چوڭ-كىچىكلىكىنى مۇۋاپىق ئىشلەش شۇنداقلا كېسەللىكنىڭ ئالدىنى ئېلىش ئۈچۈن كونترول قىلىش كېرەك.نەتىجىمىز يەنە LLPS بىلەن LSPT ئوتتۇرىسىدىكى تەڭپۇڭلۇقنىڭ αS / Tau سىستېمىسى ئۈچۈن مۇھىملىقىنى گەۋدىلەندۈردى.تامچە شەكىللىنىش باشقا سىستېمىلاردا ئوتتۇرىغا قويۇلغان 63،644 لىك تويۇنۇش شارائىتىدا بار بولغان ئاقسىل مونومېرنىڭ مىقدارىنى ئازايتىش ئارقىلىق ئامىلوئىدنىڭ يىغىلىشىدىن ساقلىنالايدۇ ، ئەمما تۆۋەن تامچە سەۋىيىدە تامچە بىرىكىش ئاستا-ئاستا ماسلىشىش ئارقىلىق ئىچكى ئاقسىلنىڭ يىغىلىشىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىشى مۇمكىن.ئاقسىل تورى..
ئومۇمىي جەھەتتىن ئالغاندا ، سانلىق مەلۇماتلىرىمىز LSPT مۇھىتىدا ئۇيۇشۇشچانلىقى ۋە قانائەتلىنەرلىك / قانائەتلىنەرلىك ئۆز-ئارا تەسىرنىڭ باغلىنىشچانلىقىنى كۈچلۈك تەكىتلەيدۇ.بولۇپمۇ ، بىز تولۇق ئۇزۇنلۇقتىكى αS / Tau441 قويۇقلۇقىنىڭ ئۈنۈملۈك بىرىكىپ ۋە يادرو ھاسىل قىلىپ ، ئاقسىلنى ئۆز ئىچىگە ئالغان ئامىلوئىدقا ئوخشاش گېروگېگېگرات ھاسىل قىلىدىغانلىقىنى ۋە تەجرىبە نەتىجىمىزگە ئاساسەن مولېكۇلا مېخانىزىمىنى ئوتتۇرىغا قويالايدىغانلىقىنى كۆرسىتىمىز.بىز بۇ يەردە دوكلات قىلغان αS / Tau سۇيۇقلۇق كوئوردېناتتىكى ئىككى خىل ئاقسىلنىڭ بىرلىشىپ توپلىنىشى ھەقىقەتەن ئىككى خىل ئاقسىلنىڭ ئۆز-ئارا يەرلىكلىشىشى بىلەن مۇناسىۋەتلىك بولۇشى مۇمكىن ، بۇ كېسەللىكنىڭ ئالاھىدىلىكى بولۇپ ، LLPS بىلەن بولغان مۇناسىۋەتنى چۈشىنىشكە تۆھپە قوشۇشى مۇمكىن. ئامىلوئىد توپلاش ، نېرۋا ئاجىزلاشتا يۇقىرى توك قاچىلانغان IDP غا يول ئاچتى.
مونومېرلىق WT-αS ، سىستېن ئۆزگىرىشى (Q24C-αS, N122C-αS) ۋە ΔCt-αS ۋارىيانتلىرى (Δ101-140) E. coli دا ئىپادىلەنگەن ۋە ئىلگىرى تەسۋىرلەنگەندەك ساپلاشتۇرۇلغان.5 mM DTT دېفففىدلىق زايومنىڭ شەكىللىنىشىنىڭ ئالدىنى ئېلىش ئۈچۈن αS سىستايىن ئۆزگىرىشىنى تازىلاشنىڭ بارلىق باسقۇچلىرىغا كىرگۈزۈلدى.Tau441 ئىزفورم (Addgene # 16316 دىن ئېلىنغان پلازما) ، ΔNt-Tau ۋارىيانتى (Δ1–150 ، IVA نى كلونلاش ئارقىلىق CTTTAAGAAGGAGATACATATGATCGCCACACCGCGG ، CATATGTATATCCTCTCTTCTTAAAGTTAAAC) primer) E. coli مەدەنىيىتى بولغان 37 ° C ۋە 180 rpm دە OD600 = 0.6–0.7 گە يەتتى ، ئىپادىلەش ئۇسۇلى IPTG بىلەن 37 سېلسىيە گرادۇستا 3 سائەت قوزغىتىلدى.11،500 xg لىك ھۈجەيرىلەرنى 4 سېلسىيە گرادۇستا 15 مىنۇت يىغىۋېلىڭ ، تەركىبىدە 150 mM NaCl بولغان تۇز سۈيى بىلەن يۇيۇڭ.لىمفا بۇففېردىكى پېلەكنى توختىتىڭ (1 L LB غا 20 مىللىمېتىر: MES 20 mM ، pH 6.8 ، NaCl 500 mM ، EDTA 1 mM ، MgCl2 0.2 mM ، DTT 5 mM ، PMSF 1 mM ، بېنزامىدېن 50 mMM ، كوپېتىن 100 mMM).سونىكلاش قەغىزى 10 تومۇرنىڭ ئامپلتۇدىيىسى% 80 مۇز ئۈستىدە ئېلىپ بېرىلدى (1 مىنۇت ، 1 مىنۇت دەم ئېلىش).بىر ئۇلترا ئاۋاز دولقۇنىدا 60 مىللىمېتىردىن ئېشىپ كەتمەڭ.E. coli lysates 95 سېلسىيە گرادۇستا 20 مىنۇت قىزىتىلدى ، ئاندىن مۇزدا سوۋۇتۇلدى ۋە 127،000 × گرامدا 40 مىنۇت مەركەزلەشتۈرۈلدى.ئايدىڭلاشتۇرۇلغان خاسىيەتلىك كېمە 3.5 kDa پەردىسىگە (Spectrum ™ Thermo Fisher Scientific, UK) قوللىنىلىپ ، 4 L لىك دىئالىزلىق بۇففېرغا (20 mM MES ، pH 6.8 ، NaCl 50 mM ، EDTA 1 mM ، MgCl2 2 mM ، DTT 2 mM) ، PMSF 0.1 mM) 10 سائەت.5 مىللىمېتىرلىق كاتەكچە ئالماشتۇرۇش ئىستونى (HiTrap SPFF ، Cytiva ، MA ، ئامېرىكا) تەڭپۇڭلاشتۇرغۇچ (20 mM MES ، pH 6.8 ، 50 mM NaCl ، 1 mM EDTA ، 2 mM MgCl2 ، 2 mM DTT ، 0.1 mM PMSF) بىلەن تەڭپۇڭلاشتۇرۇلدى.تاۋۇز لەيلىمە 0.22 μm PVDF سۈزگۈچ ئارقىلىق سۈزۈلۈپ ، مىنۇتىغا 1 مىللىلىتىرلىق سۈرئەت بىلەن ئېلىنىدۇ.تەدرىجىي يوقىتىش ئېلىپ بېرىلدى ، تاۋ% 15 ~% 30 لىك يوقىتىش بۇففېر (20 mM MES ، pH 6.8 ، 1 M NaCl ، 1 mM EDTA ، 2 mM MgCl2 ، 2 mM DTT ، 0.1 mM PMSF) بىلەن چىقىرىۋېتىلدى.بۆلەكلەر SDS-PAGE تەرىپىدىن ئانالىز قىلىنغان بولۇپ ، تاۋنىڭ مۆلچەردىكى مولېكۇلا ئېغىرلىقى بار بىر بەلۋاغنى ئۆز ئىچىگە ئالغان ھەر قانداق بۆلەكلەر 10 kDa سېنترىفۇگ سۈزگۈچ ئارقىلىق توپلانغان ۋە ئۇنىڭ ئورنىغا 10 mM HEPES ، pH 7.4 ، NaCl 500 mM ۋە DTT 2 mM بولغان بۇففېر ئورنىتىلغان. ئاخىرقى ئاقسىلنىڭ قويۇقلۇقى 100 mMM بولغان.ئاندىن ئاقسىل ئېرىتمىسى 0.22 mm PVDF سۈزگۈچتىن ئۆتۈپ ، تېز مۇزلاپ ، -80 سېلسىيە گرادۇستا ساقلانغان.ئاقسىل K18 نى پروفېسسور ئالبېرتو بوففى ياخشىلىق بىلەن تەمىنلىگەن.SDS-PAGE ۋە MALDI-TOF / TOF دەلىللىگەندەك تەييارلىقنىڭ ساپلىقى% 95 بولغان.ھەر خىل سىستايىنلارغا خىمىيىلىك ھالدا AlexaFluor488-maleimide (AF488 ، ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) ياكى TEMPOL-maleimide (تورونتو تەتقىقات خىمىيىلىك سانائىتى ، كانادا تورونتو) دەپ بەلگە قويۇلغان.سۈمۈرۈلۈش ۋە MALDI-TOF / TOF ئارقىلىق دەلىللەندى.Tau441 ، ΔNt-Tau, AggDef-Tau ۋە K18 ئوخشاش تەرتىپ بويىچە 191 ۋە 322-ئورۇنلاردا يەرلىك سىستېن قالدۇقى دەپ بەلگە قويۇلغان.SS ۋە Tau441 نىڭ قالدۇق خەرىتىلىرىنىڭ ساپ ھەققى CIDER66 ئارقىلىق ھاسىل قىلىنغان.
قاتتىق پولى L-lysine (pLK DP 90-110 تەمىنلىگۈچى NMR نىڭ تەمىنلىگۈچىسى ، ئالاماندا پولىمېرس شىركىتى ، ئامېرىكا ئالاباما شىتاتىنىڭ خۇنتىسۋىللې شەھىرى) ئۇلترا ئاۋاز دولقۇنىدىكى سۇ مۇنچىسىدا -20 سېلسىيە گرادۇسلۇق ساقلاش.PEG-8, dextran-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, USA) ۋە FITC-dextran-500 (Sigma -Aldrich, Sant Louis, MI, ئامېرىكا) سۇدا ئېرىيدىغان بولۇپ ، LLPS بۇففېردا كەڭ تارقالغان.دىئالىز بۇلغانغان تۇزنى چىقىرىپ تاشلايدۇ.ئاندىن ئۇلار تۆشۈكنىڭ چوڭلۇقى 0.22 مىللىمېتىر كېلىدىغان شىپىرىس سۈزگۈچ ئارقىلىق سۈزۈلۈپ ، ئۇلارنىڭ قويۇقلۇقى رېفراكتومېتىر ئارقىلىق ھېسابلانغان (مېتلېر تولېدو ، كولۇمبۇس ، ئوخېئو ، ئامېرىكا).LLPS ئەۋرىشكىسى ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا تۆۋەندىكى تەرتىپ بويىچە تەييارلاندى: بۇففېر ۋە چىقىرىۋېتىش ئارىلاشتۇرۇلدى ۋە 1 mM ترىس (2 كاربون ئوكسىد) فوسفىن (TCEP, Carbosynth, Compton, ئەنگىلىيە) ، 1 mM 2،2،2،2- (Ethane- 1 ، 2-دىدلىننىترىل) تېترائاكېتسىك كىسلاتا (EDTA ، كاربونسىن) ۋە% 1 ئاقسىلنى تىزگىنلەش دورىسى (PMSF 100 mM ، بېنزېمىد 1 mM ، لېپېپتىن 5 mM).ئاندىن αS ۋە بىرىكتۈرۈلگەن كۆپ قۇتۇپلىشىش (pLK ياكى Tau تاللانمىلىرى) قوشۇلدى.Thioflavin-T ۋاقىت يۈرۈشلۈك تەجرىبىسى ئۈچۈن (ThT, Carbosynth, Compton, ئەنگىلىيە) ، ThT ئومۇمىي قويۇقلۇقى αS قويۇقلۇقىنىڭ يېرىمىغا تەڭ.ئەۋرىشكىنى يۇمشاق ، ئەمما تولۇق ئارىلاشتۇرۇپ ، ئۇلارنىڭ بىردەك بولۇشىغا كاپالەتلىك قىلىڭ.نەتىجە بۆلىكىدە تەسۋىرلەنگەندەك ، ھەر بىر تەركىبنىڭ قويۇقلۇقى سىناقتىن تەجرىبىگە قاراپ ئوخشىمايدۇ.Azide تەجرىبە ۋاقتى 4 سائەتتىن ئېشىپ كەتكەندە% 0.02 (w / v) قويۇقلۇقىدا ئىشلىتىلگەن.LLPS ئەۋرىشكىسىنى ئىشلىتىپ بارلىق ئانالىزلارغا قارىتا ، ئانالىز قىلىشتىن ئىلگىرى 5 مىنۇت ئارىلاشما تەڭپۇڭلاشتۇرۇڭ.يېنىك چېچىلىش ئانالىزى ئۈچۈن ، 150 µl ئەۋرىشكە باغلانمىغان 96 قۇدۇق مىكروپلوتىغا (leClear® ، قارا ، F-Bottom / Chimney Well, Greiner bio-one, Kremsmünster, ئاۋىستىرىيە) قاچىلانغان ۋە يېپىشتۇرۇلغان پىلاستىنكا بىلەن قاپلانغان.LLP لار CLARIOstar تەخسە ئوقۇغۇچ (BMG Labtech ، گېرمانىيە ئورتېنبېرگ) نىڭ ھەل قىلىش مەركىزىدىكى سۈمۈرۈلۈش دەرىجىسىنى 350 nm ئۆلچەش ئارقىلىق نازارەت قىلىنغان.تەجرىبە 25 سېلسىيە گرادۇستا ئۈچ قېتىم ئېلىپ بېرىلغان بولۇپ ، خاتالىقلار ئوتتۇراھال ئۆلچەمدىن چەتنەپ كەتكەن.سۇيۇقلاندۇرۇش باسقۇچى ئەۋرىشكە مەركەزلەشتۈرۈش ۋە SDS-PAGE گېلى ئانالىزى ئارقىلىق مىقدارلاشقان ، سۇيۇقلاندۇرۇلغان ۋە قويۇقلاشقان باسقۇچتىكى αS بۆلەكلىرى ھەر خىل LLPS ھەل قىلىش ئۇسۇللىرىدا مىقدارلاشقان.100 مىللىمېتىرلىق LLPS ئەۋرىشكىسى 1 μM AF488 بەلگىسى بار αS نى تولۇق ئارىلاشتۇرۇپ تەييارلانغاندىن كېيىن ، 9600 × گرامدىن 30 مىنۇتقىچە مەركەزدىن قاچۇرۇش ئارقىلىق 30 مىنۇتقىچە تەييارلانغان ، ئۇنىڭدىن كېيىن ئادەتتە چۆكمە كۆرۈنگەن.خاسىيەتلىك ماددىنىڭ ئالدىنقى 50 مىللىمېتىر SDS-PAGE گېلى ئارقىلىق ئاقسىل مىقدارىغا ئىشلىتىلگەن.گېلس ChemiDoc گېلى تەسۋىر ھاسىل قىلىش سىستېمىسى (Bio-Rad تەجرىبىخانىسى ، ھېركۇلېس ، CA ، ئامېرىكا) ئارقىلىق AF488 سۈزگۈچ بىلەن سايىلىدى ياكى Coomassie داغ بىلەن بويالدى ۋە مۇۋاپىق سۈزگۈچلەر بىلەن تەسۋىرلەندى.ھاسىل بولغان بەلۋاغلار ImageJ نەشىرى 1.53i (ئامېرىكا دۆلەتلىك ساغلاملىق تەتقىقات ئورنى) ئارقىلىق تەھلىل قىلىنغان.تەجرىبە ئوخشاش بولمىغان ئىككى ئوخشىمىغان تەجرىبىدە كۆپەيتىلگەن.
ئادەتتە ، 150 مىللىمېتىر ئەۋرىشكە باغلانمىغان 96 قۇدۇق مىكروپلوتىغا قوللىنىلىپ ، لېيكا DMI6000B تەتۈر مىكروسكوپتا (Leica Microsystems ، گېرمانىيە Wetzlar ، گېرمانىيە) ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا تەسۋىرلەندى.نەق مەيدان تەجرىبىسى ئۈچۈن µ-سىيرىلما ئانگىئوگېنىز تەخسىسى (Ibidi GmbH ، Gräfelfing ، گېرمانىيە) ياكى 96 قۇدۇق پولىستىرېن مىكرو تىپلىق (Corning Costar Corp., Acton, Massachusetts) قاتارلىقلارمۇ ئىشلىتىلگەن.EL6000 گالوگېن ياكى سىماب مېتال يېرىم چىرىغى يورۇتۇش مەنبەسى سۈپىتىدە ئىشلىتىلگەن (ئايرىم-ئايرىم ھالدا BF / DIC ۋە WF تەسۋىر ھاسىل قىلىش ئۈچۈن).WF مىكروسكوپقا نىسبەتەن ، 40x چوڭايتىش ھاۋا ئوبيېكتى (Leica Microsystems ، گېرمانىيە) نۇرنى ئەۋرىشكە مەركەزلەشتۈرۈپ يىغىشقا ئىشلىتىلگەن.AF488 ۋە ThT ماركىلىق ئەۋرىشكە ئۈچۈن ، ئۆلچەملىك GFP سۈزگۈچ يۈرۈشلۈك سۈزگۈچ ھاياجانلىنىش ۋە قويۇپ بېرىش ، ھاياجانلىنىش ۋە قويۇپ بېرىش بەلۋاغ سۈزگۈچ ئايرىم-ئايرىم ھالدا 460-500 nm ۋە 512-542 nm لىق بەلۋاغ سۈزگۈچ ۋە 495 nm لىك ئەينەك.Atto647N دەپ بەلگە قويۇلغان ئەۋرىشكە ئۈچۈن ، ھاياجانلىنىش ۋە بۇلغىما قويۇپ بېرىش بەلۋاغ سۈزگۈچ بىلەن ئۆلچەملىك Cy5 سۈزگۈچ ئايرىم-ئايرىم ھالدا 628-40 nm ۋە 692-40 nm ، 660 nm لىك قوش ئەينەك ئىشلىتىلگەن.BF ۋە DIC مىكروسكوپقا ئوخشاش ئەكس ئەتتۈرۈلگەن نۇر يىغىش ئوبيېكتىنى ئىشلىتىڭ.يىغىلغان نۇر لېيكا DFC7000 CCD كامېراسىدا خاتىرىلەنگەن (گېرمانىيە Leica Microsystems ، گېرمانىيە).ئاشكارلىنىش ۋاقتى BF ۋە DIC مىكروسكوپ تەسۋىر ھاسىل قىلىش ئۈچۈن 50 ms ، WF مىكروسكوپ تەسۋىر ھاسىل قىلىش ئۈچۈن 20-100 ms.سېلىشتۇرۇش ئۈچۈن ، ThT بىلەن ئېلىپ بېرىلغان بارلىق سىناقلارنىڭ ئاشكارلىنىش ۋاقتى 100 ms.تامچە ئۇيۇشۇشنى تەسۋىرلەش ئۈچۈن ۋاقىت ھالقىغان تەجرىبە ئېلىپ بېرىلىپ ، ھەر 100 ms دە بىر نەچچە مىنۇتتا رەسىملەر توپلاندى.ImageJ (NIH ، ئامېرىكا) رەسىم ئانالىزىغا ئىشلىتىلگەن.تەجرىبە مۇشۇنىڭغا ئوخشاش نەتىجىلەر بىلەن ئۈچ قېتىم ئېلىپ بېرىلدى.
بىرىكتۈرۈش تەجرىبىسى ، FRAP ۋە 3D قايتا قۇرۇش ئۈچۈن ، ZEN 2 كۆك رەڭلىك نۇسخىسى (Carl Zeiss AG ، گېرمانىيە ئوبېركوچېن ، گېرمانىيە Zeiss LSM 880) تەتۈر شەكىللىك مىكروسكوپتا رەسىمگە ئېرىشتى.50 µl ئەۋرىشكىسى µ-Slide Angiogenesis Petri تاماقلىرىغا (Ibidi GmbH ، Gröfelfing ، گېرمانىيە) قوللىنىلدى ، گىدروفىللىق پولىمېر (ibiTreat) بىلەن بىر تەرەپ قىلىندى ۋە 63 × مايغا چۆمۈلۈش مەقسىتىگە ئورنىتىلدى (پىلان-ئاپوخرومات 63 × / NA 1.4 ماي) on DIC).رەسىملەر 458 nm ، 488 nm ۋە 633 nm ئارگون لازېرلىق سىزىق ئارقىلىق ئېنىقلىق دەرىجىسى 0.26 µm / پېكسىل ، ئاشكارلىنىش ۋاقتى 8 µs / پېكسىل ، 470-600 nm ، 493-628 nm ، ھەمدە 638-755 nm ئايرىم-ئايرىم ھالدا ThT ، AF488 ۋە Atto647N نى تەسۋىرلەشكە ئىشلىتىلگەن.FRAP تەجرىبىسى ئۈچۈن ، ھەر بىر ئەۋرىشكىنىڭ ۋاقىت ھالقىغان سۈرىتى سېكۇنتىغا 1 رامكا خاتىرىلەندى.تەجرىبە ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا ئۈچ خىل ئۇسۇلدا ئېلىپ بېرىلغان.بارلىق رەسىملەر Zen 2 كۆك رەڭلىك يۇمشاق دېتال (Carl Zeiss AG, Oberkochen, گېرمانىيە) ئارقىلىق تەھلىل قىلىنغان.FRAP ئەگرى سىزىقى نورماللاشتۇرۇلدى ، پىلانلاندى ۋە OriginPro 9.1 ئارقىلىق Zen 2 ئارقىلىق رەسىمدىن ئېلىنغان كۈچلۈكلۈك / ۋاقىت سانلىق مەلۇماتلىرىغا ماسلاشتۇرۇلدى.ئەسلىگە كەلتۈرۈش ئەگرى سىزىقى يەككە شەكىللىك مودېلغا ئورنىتىلغان بولۇپ ، مولېكۇلانىڭ تارقىلىشىنى ھېسابلاپ ، قوشۇمچە ئاقارتىش مۇددىتى بىلەن سېتىۋېلىش ئاقارتىش ئۈنۈمىنى ھېسابلايدۇ.ئاندىن بىز نامدىكى ئاقارتىش رادىئوسى ۋە ئىلگىرى بېكىتىلگەن ئەسلىگە كەلتۈرۈش يېرىم ئۆمرىنى ئىشلىتىپ كاڭ قاتارلىقلارنىڭ تەڭلىمىسىدىكى D نى ھېسابلىدۇق.5 35 كۆرسىتىلدى.
SS نىڭ يەككە سىستېن ۋارىيانتلىرى 24-ئورۇن (TEMPOL-24-αS) ۋە 122 (TEMPOL-122-αS) دىكى 4-گىدروكىسسى -2،2،6،6-تېترامېتىلپىپېرىدىن- N-oxyl (TEMPOL) بىلەن بىرىكتۈرۈلدى. ئايرىم ھالدا.ئايلانما بەلگە EPR تەجرىبىسى ئۈچۈن ، αS قويۇقلۇقى 100 mMM قىلىپ بېكىتىلدى ، PEG قويۇقلۇقى% 15 (w / v).ھەر خىل يىغىلىش شارائىتىغا نىسبەتەن ، αS: pLK نىسبىتى 1:10 بولغان ، αS: ΔNt-Tau ۋە αS: Tau441 نىسبىتى 1: 1 دە ساقلانغان.ئادەم كۆپ بولمىغان ئەھۋال ئاستىدا باغلاش ماۋزۇسىنى سىناق قىلىش ئۈچۈن ، TEMPOL-122-αS 50 mMM دا ساقلانغان ، كۆپ قۇتۇپلىشىش قويۇقلۇقى ئېشىپ ، ھەر بىر شەرتنى ئايرىم تەييارلىغان.CW-EPR ئۆلچەش ئەسۋابى Bruker ELEXSYS E580 X بەلۋاغ سپېكترى ئارقىلىق Bruker ER4118 SPT-N1 رېزوناتور ئورنىتىلغان بولۇپ ، مىكرو دولقۇنلۇق ئوچاق (SHF) چاستوتىسى ~ 9.7 GHz.تېمپېراتۇرا ° C25 قا تەڭشەلگەن ۋە سۇيۇق ئازوت كىرىستات تەرىپىدىن كونترول قىلىنغان.سپېكترا تويۇنمىغان شارائىتتا 4 مېگاۋاتلىق قۇۋۋەت ، مودۇللۇق ئامپلتۇدى 0.1 mT ، مودۇللاشتۇرۇش چاستوتىسى 100 kHz.سپېكترانىڭ كۈچلۈكلۈكى نورماللاشتۇرۇلۇپ ، ئەۋرىشكە ئارىسىدىكى ئايلىنىش قويۇقلۇقى ۋە Tau441 ياكى ΔNt-Tau (ئەۋرىشكە تەركىبىدىكى ئاقسىل ئېرىتمىسىدە بار) ئەۋرىشكىسىدىكى ماددىلارنى ئازايتىشنىڭ قالدۇق قويۇقلۇقى سەۋەبىدىن ئايلىنىشنىڭ تۆۋەنلىشى مۇمكىن.G نىڭ بېرىلگەن قىممىتى Matlab®67 دە يولغا قويۇلغان Easyspin يۇمشاق دېتالى (v. 6.0.0-dev.34) ئارقىلىق ئىشلەنگەن EPR سپېكتېل مودېلنىڭ نەتىجىسىدە قولغا كەلگەن.سانلىق مەلۇماتنى مودېل قىلىش ئۈچۈن بىر / ئىككى تەركىبلىك ئىزوتوپ مودېل ئىشلىتىلگەن.بارلىق سىگناللارنى نورماللاشتۇرغاندىن كېيىن ، قالدۇقلار ھەر بىر تەقلىدنى مۇناسىپ تەجرىبە سپېكترىدىن ئېلىش ئارقىلىق ھېسابلىنىدۇ.باغلىنىشلىق ماۋزۇ ئانالىزى ئۈچۈن ، ئۈچىنچى گۇرۇپپىنىڭ نورماللاشقان EPR سپېكترى (IIII / III) نىڭ ئىككىنچى گۇرۇپپىغا بولغان نىسپىي كۈچلۈكلىكى كۆپ قۇتۇپلارنىڭ αS بىلەن باغلىنىشىنى نازارەت قىلىشقا ئىشلىتىلگەن.ئايرىلىش تۇراقلىقىنى (Kd) مۆلچەرلەش ئۈچۈن ، ھاسىل بولغان ئەگرى سىزىق ئوخشاش ۋە مۇستەقىل باغلىنىشلىق تور بېكەتلەرنى پەرەز قىلغان تەخمىنىي مودېلغا ئورنىتىلدى.
NMR سپېكتروسكوپ تەجرىبىسى Bruker Neo 800 MHz (1H) NMR سپېكترومېتىر ئارقىلىق كرىستوپرو ۋە Z دەرىجىگە ئايرىپ ئىشلىتىلگەن.بارلىق سىناقلار 130–207 µM αS ۋە ماس كېلىدىغان αS / ΔNt-Tau ۋە pLK تەڭلىمىسى 10MM HEPES ، 100 mM NaCl ،% 10 DO ، pH 7.4 دىن پايدىلىنىپ ئېلىپ بېرىلىپ ، ° C15 قا چىققان.NMR ئارقىلىق LPS نى نازارەت قىلىش ئۈچۈن ، ئالدىن ئارىلاشتۇرۇلغان ئەۋرىشكە% 10 PEG قوشۇلدى.خىمىيىلىك يۆتكىلىشنىڭ توسقۇنلۇققا ئۇچرىشى (1b رەسىم) ئوتتۇرىچە 1H ۋە 15N خىمىيىلىك ئۆزگىرىشنى كۆرسىتىدۇ.SS 2D1H-15N HSQC سپېكترى ئالدىنقى تاپشۇرۇققا ئاساسەن تەقسىم قىلىنغان (BMRB كىرىش # 25227) ھەمدە HNCA ، HNCO ۋە CBCAcoNH نىڭ 3D سپېكترىنى خاتىرىلەش ۋە تەھلىل قىلىش ئارقىلىق دەلىللەندى.13Cα ۋە 13Cβ خىمىيىلىك بۇرۇلۇش ΔNt-Tau ياكى pLK نىڭ ئالدىدا ھېسابلىنىپ ، ساپ تاسادىپىي كاتەكچە شەكىلدىكى αS خىمىيىلىك ئۆزگىرىشكە سېلىشتۇرغاندا ، ئىككىلەمچى قۇرۇلما يۈزلىنىشىدىكى ئۆزگىرىشلەرنى ئۆلچەپ چىقتى (قوشۇمچە 5c رەسىم).R1ρ نىسبىتى hsqctretf3gpsi تەجرىبىسىنى خاتىرىلەش ئارقىلىق (برۇكېر كۈتۈپخانىسىدىن ئېلىنغان) 8 ، 36 ، 76 ، 100 ، 156 ، 250 ، 400 ۋە 800 ms كېچىكتۈرۈلگەن بولۇپ ، كۆرسەتكۈچ ئىقتىدارلىرى ئوخشىمىغان چوققا كۈچلۈكلۈكنىڭ كېچىكىشىگە تەڭشەلگەن. R1ρ ۋە ئۇنىڭ تەجرىبە ئېنىقسىزلىقىنى بەلگىلەيدىغان ۋاقىت.
ئىككى خىل ۋاقىت ھەل قىلىنغان فلۇئورېسسېنسېنلىق مىكروسكوپ تەجرىبىسى سودا ۋاقتى ھەل قىلىنغان MT200 فلۇئورېسسېنسېنسىمان مىكروسكوپتا (PicoQuant ، گېرمانىيە بېرلىن ، گېرمانىيە) ۋاقىت بىلەن مۇناسىۋەتلىك يەككە فوتون ھېسابلاش ئۈسكۈنىسى (TCSPC) ئۈسكۈنىسىدە ئېلىپ بېرىلدى.لازېرلىق دىئود بېشى تومۇر سوقۇلغان ئۆز-ئارا ھاياجانلىنىش (PIE) ئۈچۈن ئىشلىتىلىدۇ ، نۇر دەستىسى يەككە ھالەتتىكى دولقۇن دولقۇنىدىن ئۆتىدۇ ھەمدە 10 دىن 100 nW غىچە بولغان لازېر قۇۋۋىتى 481 nm ۋە 637 nm لازېرلىق سىزىق بىلەن تەڭشەلدى.بۇ فوتوننىڭ ئەڭ ياخشى ھېسابلاش سۈرئىتىگە كاپالەتلىك قىلىپ ، فوتوننى ئازايتىش ، فوتوئاكتىپلىق ۋە تويۇنۇشنىڭ تەسىرىدىن ساقلىنىدۇ..488/640 نۇمۇرلۇق ئەينەك (Semrock, Lake Forest, IL, ئامېرىكا) ئاساسلىق لىمفا پارچىلىغۇچ سۈپىتىدە ئىشلىتىلگەن.ئىشلىتىلمىگەن رادىئاتسىيە دىئامېتىرى 50 مىكرون بار تۆشۈك تەرىپىدىن توسۇلۇپ قالىدۇ ، ئاندىن فوكۇسلانغان رادىئاتسىيە 50/50 نۇر دەستىسى ئارقىلىق 2 بايقاش يولىغا ئايرىلىدۇ.تەكشۈرگۈچنىڭ ئالدىدا بەلۋاغ قويۇپ بېرىش سۈزگۈچ (Semrock ، كۆل ئورمانلىقى ، IL ، ئامېرىكا) 520/35 يېشىل بوياق (AF488) ۋە 690/70 قىزىل بوياق (Atto647N) ئىشلىتىلگەن.تەكشۈرگۈچ سۈپىتىدە يەككە فوتون قار كۆچۈش دىئودى (SPAD) (مىكرو فوتون ئۈسكۈنىلىرى ، ئىتالىيە بولزانو) ئىشلىتىلگەن.ھەر ئىككى سانلىق مەلۇمات توپلاش ۋە ئانالىز قىلىش سودا خاراكتېرلىك SymphoTime64 يۇمشاق دېتالى (PicoQuant GmbH ، بېرلىن ، گېرمانىيە) دىن پايدىلىنىپ ئېلىپ بېرىلدى.
LLPS ئەۋرىشكىسىنىڭ 50 مىكرو مىقتارى μ-Slide angiogenesis قۇدۇقلىرىغا قوللىنىلدى (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Germany).ھاسىل بولغان رەسىملەر ئاسما تامچىلىرىنىڭ ئەڭ ياخشى ئوبيېكتىپ خىزمەت ئارىلىقى ئۈچۈن قۇدۇقنىڭ ئاستىدىن 20 µm ، ئوق ئارىلىقى كەم دېگەندە 0.25 µm / پېكسىل ، كېچىكىش ۋاقتى 400 µs / پېكسىل.ھەر بىر قانالنىڭ ئوتتۇرىچە تەگلىك سىگنالىنىڭ كۈچلۈكلۈكى (PBG ، ئوتتۇرىچە + 2σ) گە ئاساسەن كۈچلۈكلۈك بوسۇغىسىنى ئىشلىتىپ سانلىق مەلۇماتنى تاللاڭ ، بۇنداق بولغاندا پەقەت سۇيۇق ئاقسىل تامچىسى ، سال ياكى داغلا تاللىنىپ ، تارقاق باسقۇچتىن كېلىپ چىقىشى مۇمكىن.ھەر بىر قانالنىڭ (τ) ئۆمرىنى تەھلىل قىلىش ئۈچۈن (AF488 نىڭ يېشىل ، «g» ۋە قىزىل ، Atto647N ئۈچۈن «r») ، تامچە ، سال ياكى داغ بار قىزىقىدىغان رايونلارنى تاللىدۇق (قوشۇمچە 1-رەسىم) ).8b) ھەمدە ئۇلارنى ئۆمۈر بويى چىرىش (τD, τR ۋە τP ئايرىم-ئايرىم ھالدا تامچە ، سال ياكى داغلارغا ئايرىم-ئايرىم ھالدا قوشۇمچە 8c رەسىمگە قاراڭ) قۇيرۇق ماسلاشتۇرۇلغان ئانالىز ۋە ئىككى تەركىبلىك چىرىش ئەندىزىسىنى ئىشلىتىپ ھاسىل قىلدى.ئوتتۇرىچە τ دىن.كۆپ كۆرسەتكۈچكە ماس كېلىدىغان فوتون بەك ئاز ئىشلەپچىقارغان ROI ئانالىزدىن چىقىرىۋېتىلدى.ئىشلىتىلگەن كېسىشمە ئوق ۋە چېكىت ئۈچۈن 104 فوتون ، تامچە 103.تامچە تامنىڭ تۆۋەن چېكى بار ، چۈنكى رەسىم ساھەسىدىكى تامچىلار ئادەتتە كىچىكرەك ۋە ئاز بولغاچقا ، تېخىمۇ كۈچلۈكلۈك قىممىتى بىلەن چىرىگەن ئەگرى سىزىققا ئېرىشىش تەس.فوتون توپلاش چېكىدىن يۇقىرى (500 سان / پېكسىل قىلىپ تەڭشەلگەن) فوتون سانى بار ROI لارمۇ ئانالىز ئۈچۈن تاشلىۋېتىلدى.قىزىقىش رايونىدىن ئېرىشكەن كۈچلۈكلۈك چىرىتىش ئەگرى سىزىقىنى مۇلازىمەت ھاياتىنىڭ بېشىدىن باشلاپ ئەڭ يۇقىرى بولغاندا% 90 (چىرىشنىڭ ئەڭ چوڭ كۈچلۈكلىكىدىن كېيىن ئازراق) بىلەن ماسلاشتۇرۇڭ ، IRF نىڭ ئارىلىشىشىغا كاپالەتلىك قىلىڭ ، شۇنىڭ بىلەن بىر ۋاقىتتا بارلىق كۈچلۈكلۈك چىرىتىشنىڭ ئوخشاشلىقىنى ساقلاڭ. تەڭشەكلەر ۋاقىت كۆزنىكى سال ۋە داغلارنىڭ 25 دىن 50 كىچە ROI ۋە تامچە 15-25 ROI ئانالىز قىلىنغان ، كەم دېگەندە 3 مۇستەقىل تەجرىبىدىن خاتىرىلەنگەن 4 دىن ئارتۇق كۆپەيتىلگەن رەسىمدىن تاللانغان رەسىملەر.ئىككى قۇيرۇقلۇق T سىناق تۈرلەر ئارا ياكى كوكراتسىيە سىستېمىسى ئوتتۇرىسىدىكى ستاتىستىكىلىق پەرقنى باھالاشقا ئىشلىتىلگەن.ھاياتلىق (τ) نى پېكسىل ئارقىلىق تەھلىل قىلىش ئۈچۈن ، ھەر بىر قانالنىڭ مەيداندىكى ئۆمرىنىڭ ئومۇمىي قويۇقلۇقى ھېسابلىنىپ ، 3/3 تەركىبلىك كۆرسەتكۈچ خاراكتېرلىك يېقىنلىشىش ئەندىزىسىنىڭ تەخمىنىي ئېلىپ بېرىلدى.ئاندىن ھەر بىر پېكسىلنىڭ ئۆمۈر كۆرۈش دەرىجىسى ئىلگىرى ھېسابلانغان τ قىممىتى ئارقىلىق ئورنىتىلغان ، نەتىجىدە ساختا رەڭلىك FLIM ماس رەسىم ھاسىل قىلىنغان.قۇيرۇق قىسمىغا ماس كېلىدىغان ئۆمۈر دائىرىسى ئوخشاش قانالنىڭ بارلىق رەسىملىرى بىلەن ئوخشاش بولۇپ ، ھەر بىر چىرىش يېتەرلىك فوتون ئىشلەپ چىقىرىپ ، ئىشەنچلىك ماسلاشتۇرىدۇ.FRET تەھلىلى ئۈچۈن ، 100 فوتوننىڭ تۆۋەن دەرىجىدىكى بوسۇغىسىنى ئىشلىتىش ئارقىلىق پېكسىل تاللانغان ، بۇ ئوتتۇرىچە 11 فوتوننىڭ تەگلىك سىگنالى (FBG).ھەر بىر قانالنىڭ فلۇئورېسسېنسىيە كۈچلۈكلىكى سىناق تەرىقىسىدە تۈزۈلگەن تۈزىتىش ئامىلى ئارقىلىق تۈزىتىلدى: 69 سپېكترا كېسىشمە يول α 0.004 ، بىۋاسىتە ھاياجانلىنىش 0.0305 ، بايقاش ئۈنۈمى 0.517.پېكسىل سەۋىيىسىدىكى FRET ئۈنۈمى ئاندىن تۆۋەندىكى تەڭلىمىنى ئىشلىتىپ ھېسابلىنىدۇ:
بۇ يەردە FDD ئىئانە قىلغۇچى (يېشىل) قانىلىدا كۆرۈلىدىغان فلۇئورېسسېنسىيەنىڭ كۈچلۈكلۈك دەرىجىسى ، FDA بولسا ۋاسىتىلىك ھاياجانلىنىشتا قوبۇل قىلغۇچى (قىزىل) قانىلىدا كۆرۈلىدىغان فلۇئورېسسېنسىيە كۈچلۈكلۈك دەرىجىسى ، FAA بولسا بىۋاسىتە ھاياجانلىنىش (قوبۇل قىلغۇچى) قانىلىدا كۆرۈلىدىغان فلۇئورېسسېنسىيە كۈچلۈكلۈك دەرىجىسى. PIE).قانالدا فلۇئورېسسېنسىيە كۈچلۈكلۈك تومۇرلىرى كۆرۈلىدۇ).
100 µl LLPS رېئاكسىيە ھەل قىلىش لايىھىسىنى ئۆز ئىچىگە ئالغان 25 µM بەلگىسى يوق مونومېرلىق Tau441 (25 µM αS بار ياكى يوق) LLPS بۇففېرغا (يۇقىرىدىكىدەك تولۇقلىنىدۇ) يېپىشقاق ياپقۇچ ياپقۇچ ۋە تامچە شەكىللەنگەن 96 قۇدۇق مىكروپلوتىغا قويۇڭ ، WF مىكروسكوپ تەرىپىدىن تەكشۈرۈلگەندىن كېيىن. تەڭپۇڭلاشتۇرۇش.10 مىنۇت ئىچىدە.ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا 48 سائەت يوشۇرۇنغاندىن كېيىن ، ئاقسىل ئوقلىرى ۋە داغلارنىڭ بارلىقى ئىسپاتلاندى.ئاندىن قۇدۇقتىكى ئوق ئۈستىدىكى سۇيۇقلۇقنى ئېھتىيات بىلەن ئېلىۋېتىڭ ، ئاندىن 50 L لىك پارچىلىغۇچ بۇففېر (10 mM HEPES ، pH 7.4 ، 1 M NaCl ، 1 mM DTT) نى قوشۇپ 10 مىنۇت سىڭدۈرۈڭ.تۇز مىقدارىنىڭ يۇقىرى بولۇشى LLPS نىڭ قالدۇق PEG سەۋەبىدىن قايتا-قايتا تەكرارلانماسلىقىغا كاپالەتلىك قىلىدۇ ، پەقەت ئېلېكتر سىتاتىك ئۆز-ئارا تەسىر پەيدا قىلغان ئاقسىل يىغىلىشى پارچىلىنىدۇ.ئاندىن قۇدۇقنىڭ ئاستىنى مىكروپېتېت ئۇچى بىلەن ئېھتىيات بىلەن بىر تەرەپ قىلىپ ، ھاسىل بولغان ھەل قىلىش چارىسى قۇرۇق كۆزىتىش قۇدۇقىغا يۆتكەلدى.ئەۋرىشكە 50 μM ThT بىلەن 1 سائەت يوشۇرۇنلانغاندىن كېيىن ، WF مىكروسكوپ ئارقىلىق يەككە داغلارنىڭ بار-يوقلۇقى تەكشۈرۈلدى.PBS دا 70 µ µM αS ئېرىتمىسىنىڭ 300 µl نى pH 7.4 ، ناترىي ئازد% 0.01 ° C 37 ، 200 rpm ئوربىتا سىلكىنىشىدە سونلانغان αS تالا تەييارلاڭ.ئاندىن ھەل قىلىش چارىسى 9600 × گرامدا 30 مىنۇت مەركەزلەشتۈرۈلۈپ ، پېلەك PBS pH 7.4 دە ئەسلىگە كەلتۈرۈلۈپ ، سونىكلاشتۇرۇلغان (1 مىنۇت ،% 50 دەۋرىيلىك ، Vibra Cell VC130 sonicator ، سونىك ، ئامېرىكا نىيۇتون ، ئامېرىكا) تالا ئەۋرىشكىسى ئەۋرىشكىسى. كىچىك تالالارنىڭ چوڭ-كىچىكلىكى بىر قەدەر چوڭ.
FCS / FCCS تەھلىلى ۋە ئىككى خىل رەڭدىكى تاسادىپىيلىق بايقاش (TCCD) ئوخشاش MT200 ۋاقىت ھەل قىلىنغان فلۇئورېسسېنسىمان فوكۇسلانغان مىكروسكوپتا (Pico-Quant ، بېرلىن ، گېرمانىيە) PIE ھالىتىنى ئىشلىتىپ FLIM-FRET مىكروسكوپ تەجرىبىسىدە ئىشلىتىلگەن.بۇ سىناقلارنىڭ لازېر كۈچى 6.0 µW (481 nm) ۋە 6.2 µW (637 nm) غا قوشۇلدى.بۇ لازېر قۇۋۋىتىنىڭ بىرىكىشى ئەڭ ياخشى ھېسابلاش نىسبىتىنى قولغا كەلتۈرۈش ۋە فوتوئاكتىپلىق ۋە تويۇنۇشتىن ساقلىنىش جەريانىدا ئىشلىتىلگەن جۈپ فتوروفورغا ئوخشاش يورۇقلۇق ھاسىل قىلىش ئۈچۈن تاللانغان.ھەر ئىككى سانلىق مەلۇمات توپلاش ۋە ئانالىز قىلىش سودا خاراكتېرلىك SymphoTime64 نەشرىنىڭ 2.3 يۇمشاق دېتالى (PicoQuant ، بېرلىن ، گېرمانىيە) دىن پايدىلىنىپ ئېلىپ بېرىلدى.
LLPS ئارقىلىق ئېرىشىلگەن ئايرىۋېتىلگەن αS / Tau توپلىمىنىڭ ئەۋرىشكىسى يەككە بۇففېردا مۇۋاپىق مونومولېكۇلا قويۇقلۇقىغا سۇيۇلدۇرۇلدى (ئادەتتە 1: 500 لىك سۇيۇلۇش ، چۈنكى بىرىكمە ئەۋرىشكە ئەۋرىشكىسىدىن ئايرىپ چىققاندا يىغىلغان ماددىلار تۆۋەن قويۇقلۇقتا بولىدۇ).ئەۋرىشكەلەر BSA ئېرىتمىسى بىلەن 1 mg / mL قويۇقلۇقىدا ئالدىن ياسالغان قاپقاققا (ئامېرىكا Corning) بىۋاسىتە قوللىنىلدى.
يېشىل ۋە قىزىل قاناللاردىكى PIE-smFRET تەھلىلى ئۈچۈن ، مونومون ھادىسىلىرى كەلتۈرۈپ چىقارغان تۆۋەن سىجىللىقتىكى سىگناللارنى سۈزۈش ئۈچۈن 25 فوتوننىڭ تۆۋەن كۈچلۈكلۈك چېكى قوللىنىلدى (دىققەت قىلىڭ ، مونومېرلار يىغىلغان ئەۋرىشكەلەرگە سېلىشتۇرغاندا ، يىغىلغان ئەۋرىشكىلەردىن كۆپ).بۇ بوسۇغا ساپ مونومېر ئەۋرىشكىسىنى ئانالىز قىلىش ئارقىلىق ئېرىشكەن مونومېرلىق αS نىڭ ئوتتۇرىچە كۈچلۈكلۈك دەرىجىسىنىڭ بەش ھەسسىسىگە تەڭ ھېسابلىنىدۇ.PIE قوزغاتقۇچ توك يولى TSCPC سانلىق مەلۇماتلىرىغا ئېرىشىش بىلەن بىللە ، ئۆمۈرلۈك ئېغىرلىقتىكى سۈزگۈچنى ئىشلىتىپ ، تەگلىك ۋە سپېكترا كېسىشمە يولىنى يوقىتىشقا ياردەم بەردى.يۇقارقى بوسۇغىدىن پايدىلىنىپ تاللانغان ئوتنىڭ كۈچلۈكلۈك دەرىجىسى پەقەت بۇففېر ئەۋرىشكىسىنىڭ يۈز بېرىش نىسبىتى ۋە كۈچلۈكلۈك دەرىجىسى / بىناسىنىڭ گىستوگراممىسىدىن بېكىتىلگەن ئوتتۇرىچە تەگلىك سىگنالى ئارقىلىق تۈزىتىلدى.چوڭ توپلام بىلەن مۇناسىۋەتلىك پارتىلاش ئادەتتە ۋاقىت ئىزىدا ئۇدا بىر نەچچە ساندۇقنى ئىگىلەيدۇ (1 ms قىلىپ تەڭشەلدى).بۇ خىل ئەھۋال ئاستىدا ، ئەڭ چوڭ قۇۋۋەت ساندۇقى تاللاندى.FRET ۋە stoichiometric تەھلىلى ئۈچۈن ، نەزەرىيە جەھەتتىن بېكىتىلگەن گامما ئامىلى 0.5 (0.517) ئىشلىتىلگەن.ئىشلىتىلگەن ھاياجانلىنىش لازېر كۈچىدە سپېكترا يول ئېغىزى ۋە بىۋاسىتە ھاياجانلىنىش تۆھپىسى ناھايىتى ئاز (تەجرىبە ئارقىلىق بېكىتىلىدۇ).FRET نىڭ پارتلاشتىكى ئۈنۈمى ۋە ستوئىئومىتىرىيىسى تۆۋەندىكىدەك ھېسابلىنىدۇ.